楊 蕾

哈藥集團(tuán)制藥總廠科研開發(fā)中心 150000

試析酶法合成頭孢氨芐工藝

楊 蕾

哈藥集團(tuán)制藥總廠科研開發(fā)中心 150000

目的：探討酶法合成頭孢氨芐工藝優(yōu)化，并對(duì)母液中的母核進(jìn)行回收利用。方法：通過對(duì)酶催化法的合理利用，在選定母核和?；w的基礎(chǔ)上，在水相中以固定化青霉素?；复呋铣深^孢氨芐。在這一條件下，對(duì)反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間以及投酶量等條件進(jìn)行優(yōu)化處理，進(jìn)一步考察頭孢氨芐摩爾收率以及產(chǎn)品質(zhì)量。結(jié)果：在標(biāo)準(zhǔn)工藝優(yōu)化后，頭孢氨芐摩爾收率在 85%以上，而套用母液中回收的的7-ADCA后頭孢氨芐摩爾收率在91%以上，明顯高于當(dāng)前化學(xué)法的收率，可知產(chǎn)品質(zhì)量合格。結(jié)論：酶法合成頭孢氨芐工藝具有良好的應(yīng)用價(jià)值，其反應(yīng)條件溫和，且收率較高，與當(dāng)前可持續(xù)發(fā)展理念保持高度一致，屬于綠色合成工藝。

酶法；合成；頭孢氨芐；青霉素酰化酶；7-ADCA

頭孢氨芐是抗生素中的一種，屬于半合成頭孢菌素，在實(shí)際應(yīng)用中能夠?qū)?xì)胞壁的合成進(jìn)行有效抑制，從而對(duì)細(xì)菌進(jìn)行有效遏制，在臨床醫(yī)學(xué)中具有良好的應(yīng)用價(jià)值。頭孢氨芐對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均具有良好的抗菌作用，注射后能夠被較快速度的吸收，在加入增效抗炎因子后，頭孢氨芐在實(shí)際應(yīng)用中殺菌能力更強(qiáng)，高出青霉素類殺菌藥物的20倍左右。本文主要就酶法合成頭孢氨芐工藝進(jìn)行研究和分析，通過對(duì)反應(yīng)投酶量、投料比、反應(yīng)溫度以及反應(yīng)時(shí)間等工藝參數(shù)進(jìn)行調(diào)整和控制，以保證產(chǎn)品質(zhì)量滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。通過本次研究，旨在為醫(yī)藥領(lǐng)域人士提供借鑒。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原材料

在本次實(shí)驗(yàn)研究中，選用PGM、PGA，7-ADCA作為實(shí)驗(yàn)主要原材料。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

BIO-2020生物反應(yīng)器、自動(dòng)電位滴定儀、SIGMA高速離心機(jī)、BX-180循環(huán)冷凍機(jī)、高效液相、SevenEasyPH計(jì)、真空干燥箱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

在酶催化合成過程中，將一定量的合成酶加入到合成反應(yīng)罐中，在PH7.5條件下將7-ADCA溶解，并轉(zhuǎn)移至合成罐內(nèi)。將PGM溶解液滴加至合成罐內(nèi)，并以濃NH3·H2O對(duì)合成反應(yīng)中的PH值進(jìn)行合理控制。待PGM滴加完成后，以標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的驗(yàn)算和氨水對(duì)反應(yīng)PH值進(jìn)行有效控制，通過對(duì)循環(huán)冷凍機(jī)進(jìn)行合理應(yīng)用，將合成反應(yīng)溫度控制在合理范圍內(nèi)，并對(duì)7-ADCA轉(zhuǎn)化率進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，并以相關(guān)檢測(cè)結(jié)果為主要依據(jù)明確酶催化合成的反應(yīng)重點(diǎn)，以98%以上的轉(zhuǎn)化率作為終止反應(yīng)的標(biāo)志。

在反應(yīng)器底部篩網(wǎng)以母液作為主要分離物質(zhì)，將頭孢氨芐和固體酶進(jìn)行循環(huán)洗滌，紙質(zhì)母液無白色物質(zhì)，方實(shí)現(xiàn)二者的有序分離。在重結(jié)晶過程中，處于20℃條件下，以濃鹽酸對(duì)溶于母液中的濾餅進(jìn)行溶解，及時(shí)經(jīng)過100μm濾紙并轉(zhuǎn)移至結(jié)晶罐，以標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的氨水進(jìn)行調(diào)晶處理。在調(diào)晶過程中，掌握好一調(diào)與二調(diào)的PH值、溫度以及養(yǎng)晶時(shí)間，從而促進(jìn)重結(jié)晶的順利實(shí)現(xiàn)。待抽濾、丙酮洗滌后，將其在45℃條件下進(jìn)行干燥處理，待干燥兩小時(shí)后，方可獲得頭孢氨芐成品。

在7-ADCA回收過程中，PGA作用下能夠促進(jìn)酶法頭孢氨芐重結(jié)晶母液的裂解，在20℃條件下，PH值為8.0-8.3之間，將裂解時(shí)間控制在90min，能夠?qū)⒚概c回收苯甘氨酸實(shí)現(xiàn)有序分離。以標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的納濾膜對(duì)裂解反應(yīng)清液進(jìn)行濃縮處理。待弄多液脫碳后，掌握好一調(diào)與二調(diào)的PH值及養(yǎng)晶時(shí)間。待抽濾后，加以洗滌干燥處理，可得到7-ADCA粗品。將回收完成的7-ADCA作為下一批次頭孢氨芐合成反應(yīng)套用材料。

2 分析結(jié)果與討論

2.1 投酶量對(duì)合成收率的影響

PGM：7-ADCA為1.8，溫度為20℃，PH7.0的條件下，每升反應(yīng)液投酶量分別為1.4、1.6、1.8、2.0和2.2KU，檢測(cè)7-ADCA的轉(zhuǎn)化率判斷反應(yīng)終點(diǎn)，最終檢測(cè)成品收率。每個(gè)投酶量重復(fù)實(shí)驗(yàn)3批，取收率平均值進(jìn)行比較。結(jié)果顯示投酶量在1.8KU/L時(shí)，頭孢氨芐平均摩爾收率最高；進(jìn)一步增加投酶量會(huì)加大側(cè)鏈分解程度，降低摩爾收率(圖1)。

圖1 投酶量對(duì)合成收率的影響

2.2 PGM和7-ADCA投料比對(duì)合成收率的影響

在投酶量1.8KU/L，溫度20℃，H=6.8的條件下，PGM:7-ADCA分別為1.0、1.2、1.4、1.6、1.8，檢測(cè)7-ADCA的轉(zhuǎn)化率判斷反應(yīng)終點(diǎn)，最終檢測(cè)成品收率。每個(gè)側(cè)鏈加量重復(fù)實(shí)驗(yàn)3批，取收率平均值進(jìn)行比較，結(jié)果顯示PGM:7-ADCA=1.2:1時(shí),頭孢氨芐摩爾收率最高；若增加側(cè)鏈投料比例，過多的側(cè)鏈分解物抑制合成酶活力，合成反應(yīng)收率反而降低(圖2)。

圖2 側(cè)鏈：底物投料比對(duì)合成收率的影響

2.3 酶催化合成反應(yīng)溫度合成收率的影響

在投酶量1.8KU/L，PGM:7-ADCA=1.2:1，pH6.8的條件下，合成反應(yīng)溫度分別為12、14、16、18和20℃，檢測(cè)7-ADCA的轉(zhuǎn)化率判斷反應(yīng)終點(diǎn)，最終檢測(cè)成品收率。每個(gè)溫度條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)3批，取收率平均值進(jìn)行比較，結(jié)果顯示反應(yīng)溫度16℃，頭孢氨芐摩爾收率最高；溫度過低合成反應(yīng)進(jìn)行緩慢，底物轉(zhuǎn)化慢；溫度過高，側(cè)鏈加速分解，影響合成酶活力及合成收率(圖3)。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)合成收率的影響

3 結(jié)論

就頭孢氨芐的合成來看，傳統(tǒng)合成方法下主要是在化學(xué)方法下將母核與側(cè)鏈有機(jī)結(jié)合，促進(jìn)頭孢氨芐的形成。在這一化學(xué)過程中，在縮合、水解以及結(jié)晶等工序操作中，受到基團(tuán)保護(hù)、工藝路線較長(zhǎng)以及強(qiáng)毒性化學(xué)物質(zhì)等因素的影響，導(dǎo)致頭孢氨芐制備過程中極易出現(xiàn)有毒有害物質(zhì)殘留而影響藥品制備質(zhì)量。隨著醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)各項(xiàng)技術(shù)的不斷進(jìn)步，酶法合成頭孢氨芐工藝逐漸受到社會(huì)的高度重視。其與傳統(tǒng)合成方式相比，具有反應(yīng)條件溫和、工藝操作簡(jiǎn)單以及清潔性、安全性等優(yōu)勢(shì)，能夠產(chǎn)生良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益，在藥品生產(chǎn)領(lǐng)域內(nèi)具有廣闊的發(fā)展空間。

綜合以上實(shí)驗(yàn)因素：酶法合成頭孢氨芐的實(shí)驗(yàn)條件為投酶量1.8KU/L，PGM:7-ADCA=1.2:1，反應(yīng)溫度 T=16℃，反應(yīng)pH=6.2～6.5，反應(yīng)時(shí)間2.5h，頭孢氨芐摩爾收率最高。經(jīng)PGA裂解母液回收7-ADCA，與用β-萘酚回收7-ADCA的回收率相當(dāng)，回收率可達(dá)85%，回收的7-ADCA按一定比例投入酶催化合成反應(yīng)，酶法頭孢氨芐的摩爾收率可達(dá)91%以上，該收率遠(yuǎn)高于目前國(guó)內(nèi)化學(xué)法生產(chǎn)的收率(89%)，成品含量≥98.5%，各項(xiàng)檢驗(yàn)指標(biāo)符合標(biāo)準(zhǔn)。酶法合成頭孢氨芐方法在輔料和工藝上均區(qū)別于傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法，反應(yīng)過程中避免使用吡啶、特戊酰氯、N,N二甲基甲酰胺(DMF)等有毒有害物質(zhì)，且工藝路線簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和；母液回收過程中使用酶法裂解回收7-ADCA工藝替代頭孢氨芐和β-萘酚形成復(fù)鹽后的分離工藝，避免了β-萘酚和二氯甲烷的回收；回收套用后頭孢氨芐摩爾收率比化學(xué)法工藝提高2%，新的酶法合成工藝既降低了生產(chǎn)成本也降低了環(huán)保壓力，屬于綠色環(huán)保工藝。酶法合成頭孢氨芐代替化學(xué)法合成工藝也將會(huì)對(duì)酶法合成抗生素的發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

[1]王艷艷，袁國(guó)強(qiáng)，朱科，王進(jìn)賢 酶法合成頭孢氨芐工藝研究[J].《中國(guó)抗生素雜志》, 2013, 38(7):516-519

[2]賈方聰，崔楠 酶法合成頭孢氨芐工藝研究[J].《科學(xué)與財(cái)富》,2015(2):208-208

R943

A

1672-5018（2016）10-017-02