王紹杰周 索

（1.河南天冠企業(yè)集團有限公司，河南 南陽 473000；2.南陽師范學院，河南 南陽 473061）

鹽脅迫下G蛋白在擬南芥種子萌發(fā)和根生長發(fā)育中的作用

王紹杰1周 索2

（1.河南天冠企業(yè)集團有限公司，河南 南陽 473000；2.南陽師范學院，河南 南陽 473061）

以擬南芥的野生型（WS）、異三聚體G蛋白α亞基基因GPA1缺失突變體（gpα1-1，gpα1-2）和超表達突變體（wGα，cGα）的種子為材料，在添加不同濃度NaCl鹽溶液的MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察種子的萌發(fā)及根生長情況。結果表明：隨著鹽脅迫程度的增加，不同基因型擬南芥種子萌發(fā)率、存活率、主根長度及側根數(shù)目均明顯呈下降趨勢；在同一濃度下，缺失型突變體的萌發(fā)率和存活率高于超表達突變體和野生型；缺失型突變體的主根長度和側根的數(shù)目也大于野生型和超表達突變體。初步說明了植物異三聚體G蛋白α亞基在擬南芥種子萌發(fā)及根生長發(fā)育過程中起負調控作用。

擬南芥；鹽脅迫；種子萌發(fā)；異三聚體G蛋白

擬南芥（Arabidopsis thaliana），因其基因組簡單，突變體眾多，生長發(fā)育指標資料全面等特點而被廣泛使用，成為一種典型的模式植物。NaCl對擬南芥種子萌發(fā)、存活及根生長有抑制作用［1］。但NaCl抑制過程中的信號轉導途徑目前還不清楚。

高等真核生物中，異三聚體G蛋白（簡稱G蛋白）參與的跨膜信號轉導途徑是一種常見且保守的作用機制，胞外信號通過與質膜相結合的受體和質膜內表面的異三聚體G蛋白，將信號傳遞給效應器并產生胞內第二信使，再由后者調節(jié)下游效應器及酶活性。大量的藥理學及分子細胞生物學證據(jù)表明，植物異三聚體G蛋白參與了諸多發(fā)育過程，如氣孔開關、細胞周期調節(jié)、根的發(fā)育等，并在植物感知環(huán)境信號反應中起著重要的作用。異三聚體G蛋白由α、β、γ3個亞基組成，目前認為G蛋白α亞基（Gα）在信號轉導過程中發(fā)揮主導作用。目前，國際上通用的研究G蛋白α亞基功能的材料是擬南芥G蛋白α亞基基因GPA1缺失突變體（gpα1-1，gpα1-2）和超表達突變體（wGα，cGα）。

為了探索異三聚體G蛋白α亞基在鹽脅迫下對擬南芥種子萌發(fā)及根生長發(fā)育過程中的調控作用，本試驗以擬南芥野生型（WS）、超表達突變體（wGα，cGα）、缺失突變體（gpα1-1，gpα1-2）5種基因型擬南芥種子的萌發(fā)率、存活率、主根長度、側根數(shù)目等指標進行測量，以期為G蛋白α亞基是否參與鹽脅迫下種子萌發(fā)、根生長發(fā)育調節(jié)提供科學的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）的野生型（WS）和異三聚體G蛋白α亞基基因GPA1缺失突變體（gpα1-1，gp1-2）和超表達突變體（wGα，cGα）5種基因型種子。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制和分裝。培養(yǎng)無菌擬南芥種子的培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，添加一定量的NaCl，使最終濃度分別達到0、40、80、120、160 mmol/L和200 mmol/L（經預備試驗反復證明當NaCl濃度大于200 mmol/L時，5種基因型都不萌發(fā)），每配方6皿，共需30個培養(yǎng)皿。按常規(guī)先將配制好的培養(yǎng)基放入錐形瓶中，每瓶100 mL共5瓶，2種超表達突變體基因型的培養(yǎng)基必須準確每瓶25 mL（培養(yǎng)基要加激素100 μL/L）共10瓶，高壓滅菌（121℃，20 min），將每個100 mL錐形瓶分裝為4個9.0 cm直徑的培養(yǎng)皿（培養(yǎng)皿也經高壓滅菌），做好標記，放入超凈工作臺中，以便接種。

1.2.2 種子的消毒和接種。擬南芥種子經表面（75%乙醇，30 s）和深層（HgCl2，4 min，無菌水洗3次）消毒后，用移液槍將擬南芥種子點種于相應的培養(yǎng)皿上，在培養(yǎng)室（22℃、光強6 000～8 000 Lux、16 h/8 h光暗周期，相對濕度70%）培養(yǎng)，獲得無菌苗，每天觀察萌發(fā)情況，10 d后統(tǒng)計萌發(fā)數(shù)，存活率，測量主根長度和側根數(shù)目3次，取平均值。

1.2.3 擬南芥種子萌發(fā)率的測定。待種子長出芽時，對每個培養(yǎng)皿中擬南芥種子的萌發(fā)數(shù)目進行統(tǒng)計并算出萌發(fā)率。萌發(fā)率=萌發(fā)種子數(shù)/接種種子總數(shù)。

1.2.4 擬南芥種子存活率的測定。待4周幼苗長出三四片葉子后，統(tǒng)計各培養(yǎng)皿中正常生長的幼苗，并算出擬南芥的存活率。存活率=正常生長幼苗數(shù)目/接種種子總數(shù)。

1.2.5 擬南芥主根長度和側根數(shù)目測量。待4周后，取6張足夠大的黑紙，放在燈光下。取同一鹽濃度處理下的不同基因型擬南芥幼苗各45株，將其平行擺放在黑紙上，測量主根長度及觀察側根數(shù)目，并記錄主根長度和側根的數(shù)目。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫下5種基因型擬南芥種子的萌發(fā)率

由表1、圖1可以看出，鹽脅迫對擬南芥種子的萌發(fā)率具有濃度依賴。5種基因型的擬南芥種子萌發(fā)率隨著鹽濃度的增加而呈下降趨勢，160～200 mmol/L鹽脅迫條件對種子萌發(fā)有較大的影響，種子幾乎不萌發(fā)，表明隨著鹽濃度的增加，各基因型擬南芥種子的萌發(fā)受到的抑制增大；同一濃度下不同基因型擬南芥的萌發(fā)率相比，缺失型突變體的萌發(fā)率大于超表達突變體和野生型，表明缺失型突變體擬南芥種子萌發(fā)受到的抑制小于超表達突變體和野生型。

表1 NaCl對不同基因型擬南芥種子萌發(fā)率的影響

表2 NaCl對不同基因型擬南芥種子存活率的影響

圖1 NaCl對不同基因型擬南芥種子萌發(fā)率的影響

2.2 鹽脅迫下5種基因型擬南芥幼苗的存活率鹽脅迫對不同基因型擬南芥種子的存活都有抑制作用，第5天40～120 mmol/L鹽脅迫的擬南芥都長出葉子，而160 mmol/L鹽脅迫的擬南芥萌發(fā)的種子長出子葉后就逐漸枯萎，不能進一步生長真葉。將能夠生長出真葉的幼苗作為能夠存活的依據(jù)，統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫培養(yǎng)皿中，鹽濃度超過160 mmol/L的培養(yǎng)基中，擬南芥種子萌發(fā)出子葉后，隨著時間的延長，最終均陸續(xù)死亡。由表2、圖2可知，5種基因型的擬南芥隨著鹽濃度的升高，其存活率呈下降趨勢，受到的抑制逐漸增大，同一鹽濃度下缺失型突變體的存活率大于超表達突變體和野生型，表明缺失型突變體受到的抑制低于超表達突變體和野生型。

圖2 NaCl對不同基因型擬南芥種子存活率的影響

2.3 鹽脅迫下5種基因型擬南芥幼苗的主根長度

種子萌發(fā)到第10天，測量不同鹽濃度培養(yǎng)下的5種基因型擬南芥幼苗的主根長度。由表3、圖3可以看出，在鹽脅迫下，隨著NaCl濃度的增加，擬南芥幼苗的主根長度明顯降低，同一濃度下缺失型突變體的主根長度大于超表達突變體和野生型，野生型擬南芥的根也稍長于超表達型，說明在同一濃度下，不同基因型擬南芥受到的抑制情況為超缺失型＜野生型＜表達型。

表3 NaCl對不同基因型擬南芥主根長度的影響

表4 NaCl對不同基因型擬南芥?zhèn)雀鶖?shù)目的影響

圖3 NaCl對不同基因型擬南芥主根長度的影響

2.4 鹽脅迫下5種基因型擬南芥的側根數(shù)目

圖4 NaCl對不同基因型擬南芥?zhèn)雀鶖?shù)目的影響

由表4、圖4可知，在鹽脅迫下，隨著NaCl濃度的增加，擬南芥幼苗的側根數(shù)目明顯減少，同一濃度下缺失型擬南芥的側根數(shù)目要大于野生型和超表達型，而野生型的也稍多于超表達型擬南芥，說明他們受到的抑制情況為：超表達型＞野生型＞缺失型。

3 討論與結論

作為細胞質膜上重要的跨膜信號轉導分子，異三聚體G蛋白在植物發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，已知G蛋白參與種子萌發(fā)［2］、光控發(fā)育［3］以及包括生長素、赤霉素和脫落酸在內的多種植物激素［4］對植物生長發(fā)育的調控。周索等［5，6］曾指出異三聚體G蛋白參與生長素調控的擬南芥?zhèn)雀L發(fā)育過程。Ullah等［7］曾指出，G蛋白α亞基參與促進葉和莖細胞的細胞分裂，其基因缺失后導致有絲分裂頻率降低，超表達突變體細胞分裂速度增加。Okamoto等［3］曾報道G蛋白α亞基超表達可以明顯增強光照對植物生長的抑制，推測Gα亞基缺失將會導致這種抑制作用的減弱,而使生長加速。Tanaka等［4］報道G蛋白參與了赤霉素信號轉導,并可以增強生長對于赤霉素的敏感性。楊振等［8］發(fā)現(xiàn)Gα亞基參與了擬南芥器官（植株高度/葉片形狀和長角果）的伸長生長過程，并證實Gα亞基起負調控作用。

本研究結果顯示，隨NaCl脅迫程度的增加不同基因型擬南芥種子萌發(fā)率、存活率、主根長度和側根數(shù)目均明顯呈下降趨勢。在同一濃度下，缺失型突變體的萌發(fā)率和存活率高于超表達突變體和野生型，野生型又稍大于超表達型；缺失型突變體的主根長度和側根的數(shù)目，也大于野生型和超表達突變體，野生型又稍多于超表達型。G蛋白α亞基缺失之后，G蛋白表達減弱，調控作用被減弱，因此導致缺失突變體萌發(fā)率，存活率比野生型和超表達突變體高，根長度較他們長，側根數(shù)目較他們多。表明異三聚體G蛋白參與了鹽脅迫下擬南芥種子萌發(fā)及根生長發(fā)育的調節(jié)。本研究初步證明鹽脅迫下G蛋白α亞基在擬南芥種子萌發(fā)及根生長發(fā)育中起負調控作用。但G蛋白α亞基是否參與其他離子脅迫下擬南芥種子萌發(fā)及根生長發(fā)育的信號轉導途徑以及G蛋白α亞基的下游效應器還不清楚，還有待于進一步研究確定。

［1］柳海龍，杜娟，吳立柱，等.擬南芥種子萌發(fā)及幼苗生長對干旱和NaCl脅迫的響應［J］.河北農業(yè)大學學報，2008（2）：12-15.

［2］Ullah H，Chen J G，Wang S.Role of the heterotrimeric G-protein in regulation of Arabidopsis seed germination［J］.Plant Physiol，2002（2）：897-907.

［3］Okamoto H，Matsui M，Deng XW.Over-expression of the heterotrimeric G protein a-subuint enhances phytochrome-mediated inhibition of hypocotyls elongation Arabidopsis［J］.Plant Cell，2001（13）：639-651.

［4］Tanaka MU，F(xiàn)ujisawa Y，Kobayashi M.Rice dwarf mutant d1,which is defective in the subunit of the heterotrimeric G protein,affects gibberellin signal transduction［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica，2000（21）：11638-11643.

［5］周索，杜麗，趙松峰，等.Ca2+參與異三聚體G蛋白調控的擬南芥?zhèn)雀L發(fā)育過程.中國農業(yè)大學學報，2008（5）：5-10.

［6］周索，杜麗，尚忠林，等.異三聚體G蛋白在IAA誘導的擬南芥根生長發(fā)育中的作用［J］.西北農業(yè)學報，2007（6）：187-191.

［7］Ullah H，Chen JG，Young JC.Modulation of cell proliferation by heterotrime

ric G-protein in Arabidopsis［J］.Science，2001（5524）：2066-2069.

［8］楊振，劉婷，武延生，等.異三聚體G蛋白在擬南芥生長發(fā)育過程中的作用［J］.河北師范大學學報，2005（3）：299-304.

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