甄張赫，朱銳丹，秦松，陳海龍，蒲洋，翁羽翔2,*，李文軍*

( 1.中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所，山東 煙臺(tái) 264003；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.中國(guó)科學(xué)院物理研究所 北京凝聚態(tài)物理國(guó)家研究中心/軟物質(zhì)物理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190；4.中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心，山東 青島 266071；5.魯東大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025)

1 引言

藻類進(jìn)行光合作用的第1步是捕捉光能并將光能傳遞至光合反應(yīng)中心，該過(guò)程是由藻類捕光蛋白完成的[1]。藻膽體是藍(lán)藻和紅藻中非常重要的捕光復(fù)合體，主要由桿結(jié)構(gòu)和核結(jié)構(gòu)兩部分組成[2-3]。藻膽體的桿結(jié)構(gòu)可以幫助藻類在水下的弱光環(huán)境高效地捕捉光能，而藻膽體的核結(jié)構(gòu)可以將桿結(jié)構(gòu)捕捉的光能以95%以上的效率傳遞至光合反應(yīng)中心[4-5]。

別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC）三聚體是紅、藍(lán)藻藻膽體核結(jié)構(gòu)的主要組成成分之一[6]。晶體結(jié)構(gòu)揭示（圖1），APC三聚體是由3個(gè)單體組成的厚約為3 nm，直徑約為13 nm的圓盤狀結(jié)構(gòu)，中央存在1個(gè)直徑約為3.5 nm的可插入連接蛋白的空腔[7-8]。APC三聚體每個(gè)單體包含1個(gè)α亞基和1個(gè)β亞基，每個(gè)α亞基和β亞基的Cys84位點(diǎn)都結(jié)合有1個(gè)藻藍(lán)膽素（phycocyanobilin，PCB），這些 PCB 可以與氨基酸共同構(gòu)成發(fā)色團(tuán)，發(fā)色團(tuán)參與了APC的捕光和能量傳遞[9]。

圖1 別藻藍(lán)蛋白三聚體晶體結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Allophycocyanin trimer crystal structure

雖然APC三聚體只結(jié)合有6個(gè)PCB，但APC三聚體內(nèi)部的能量傳遞卻非常快速[10]。APC三聚體Cys84位點(diǎn)上的兩個(gè)發(fā)色團(tuán)結(jié)構(gòu)與藍(lán)藻的藻藍(lán)蛋白（Cyanobacteria-phycocyanin，C-PC）三聚體 Cys84位點(diǎn)上的兩個(gè)發(fā)色團(tuán)的結(jié)構(gòu)相似，但是APC三聚體電子弛豫的速度是C-PC的10倍[7,11]。APC三聚體的能量吸收光譜從620 nm傳遞到650 nm的時(shí)間約為200～600 fs[12-13]。這種快速的能量傳遞方式被認(rèn)為與APC相鄰單體之間的兩個(gè)發(fā)色團(tuán)（β84PCB，α84PCB）的強(qiáng)耦合相關(guān)。由于強(qiáng)耦合作用產(chǎn)生了電子態(tài)的能級(jí)分裂，導(dǎo)致激發(fā)態(tài)波函數(shù)在兩個(gè)色素分子間離域，并加速了能量傳遞進(jìn)程[9]。在其他文獻(xiàn)報(bào)道的超快時(shí)間分辨光譜的動(dòng)力學(xué)分析中，均擬合有10～30 fs的超短時(shí)間常數(shù)。通常認(rèn)為，這可能反映了激子態(tài)上的弛豫時(shí)間[9]。并且，有研究發(fā)現(xiàn)[14]，APC的初始各向異性明顯大于0.4，這證明APC三聚體中存在著相干激發(fā)態(tài)的色素分子對(duì)。目前，有觀點(diǎn)認(rèn)為，在隱藻藻膽蛋白PE545以及PC645中存在的強(qiáng)耦合色素分子對(duì)導(dǎo)致了量子相干節(jié)拍的產(chǎn)生，且部分離域振動(dòng)可使能量傳遞速率增強(qiáng)[15-16]。因此，別藻藍(lán)蛋白中存在的強(qiáng)激子耦合可能也會(huì)引發(fā)相干能量轉(zhuǎn)移，以加速并輔助APC的定向能量轉(zhuǎn)移，這可能是藻膽體核心結(jié)構(gòu)高效并快速轉(zhuǎn)移能量的主要原因[14]。但是3種機(jī)制是如何相互配合的，一直以來(lái)是APC高效傳能的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

研究APC的高效光能傳遞規(guī)律，需要具備高純度的APC亞基、單體和三聚體等，如果從藍(lán)藻中制備，需要引入SDS、尿素或者極端pH作為蛋白質(zhì)變性條件，這個(gè)過(guò)程雖然能獲得部分單體或者亞基，但是獲得的亞基、單體和三聚體等往往出現(xiàn)降解，產(chǎn)生混合物，如果加大變性條件，又會(huì)損傷APC的發(fā)色團(tuán)空間結(jié)構(gòu)，造成測(cè)試結(jié)果的不準(zhǔn)確甚至錯(cuò)誤。此外，目前一些報(bào)道所用的APC樣品為商品化的凍干蛋白粉末，凍干、復(fù)溶等步驟都有可能對(duì)蛋白構(gòu)象造成不易覺(jué)察的傷害，從而導(dǎo)致色基微環(huán)境發(fā)生變化。所以，APC自組裝過(guò)程中，藻膽素分子的構(gòu)象變化是否影響色素耦合狀態(tài)，進(jìn)一步改變?cè)迥懰胤肿拥哪芰繝顟B(tài)一直是研究APC高效傳能的瓶頸。

針對(duì)APC高效傳能機(jī)制以及對(duì)APC自組裝過(guò)程中藻膽素及傳能關(guān)系的研究，本文以重組異源表達(dá)[17-18]的具有和天然APC一樣結(jié)構(gòu)特性和穩(wěn)態(tài)光譜特性的重組別藻藍(lán)蛋白（recombinant allophycocyanin，rAPC）單體和三聚體為實(shí)驗(yàn)材料[17,19-20]，通過(guò)各種穩(wěn)態(tài)和瞬態(tài)光譜技術(shù)對(duì)rAPC三聚體不同時(shí)間尺度的能量傳遞過(guò)程進(jìn)行了檢測(cè)，探究rAPC自組裝過(guò)程中，藻膽素分子的構(gòu)象變化，其產(chǎn)生的色素耦合狀態(tài)是否會(huì)改變?cè)迥懰胤肿拥哪芰繝顟B(tài)；探究重組rAPC自組裝過(guò)程中，伴隨結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的變化，長(zhǎng)距離的福斯特共振能量轉(zhuǎn)移機(jī)制（f?ster resonance energy transfer，F(xiàn)RET)、短距離的激子耦合理論（dexter mechanism）以及空間離域的“相干態(tài)傳能”3種機(jī)制是如何相互配合以實(shí)現(xiàn)APC的高效能量傳遞。這將為繼續(xù)深入研究rAPC激發(fā)態(tài)的能量傳遞過(guò)程，揭示藻膽體核心高效快速的能量轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 樣品準(zhǔn)備及鑒定

將本實(shí)驗(yàn)室自構(gòu)建的含有rAPC質(zhì)粒的生物工程大腸桿菌接種于含卡那霉素（索萊寶，北京）（濃度：50 μg/mL）及壯觀霉素（麥克林，上海）（濃度：50 μg/mL）的 LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基（索萊寶，北京）中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日以1%接種量重新接種至LB培養(yǎng)基中（含抗性），37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期（OD600nm約為0.7）（OD為光吸收密度），然后加入IPTG（索萊寶，北京）（濃度：0.5 mmol/L），28℃ 過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)。18 h后離心（12 000×g，2 min）收集菌體。此時(shí)，對(duì)誘導(dǎo)前后的菌體以熒光顯微鏡（Olympus BX51，日本）進(jìn)行藍(lán)光和綠光激發(fā)，并采集熒光發(fā)射圖。其中質(zhì)粒構(gòu)建、蛋白表達(dá)及誘導(dǎo)的方法參考Liu等[17]的方法。

將菌體用20 mmol/L的緩沖鹽緩沖液（pH：6.0）重懸（濃度：0.1 g/mL），以細(xì)胞超聲破碎儀（功率：300 W）（新芝，寧波）破碎（破碎3 s，停止5 s）至重懸液均一。破碎后離心（10 000×g，30 min，4℃）并收集上清液。上清液用孔徑為0.22 μm濾膜過(guò)濾后，通過(guò)重力法過(guò)Ni-IDA瓊脂糖凝膠柱（康為世紀(jì)，中國(guó)北京）進(jìn)行純化。對(duì)純化收集得到的rAPC通過(guò)30 kD超濾管（Millipore，美國(guó)）濃縮去咪唑，然后通過(guò)不連續(xù)蔗糖梯度密度（蔗糖密度依次為：0.3 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L）繼續(xù)進(jìn)行純化，離心力為 200 000×g，溫度為 4℃，時(shí)間為 21 h。rAPC純化方法參考Liu等[17]、李文軍等[20]的方法。對(duì)收集的藍(lán)色rAPC三聚體蛋白進(jìn)行各種光譜檢測(cè)，同時(shí)對(duì)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE蛋白膠鑒定。部分rAPC三聚體用于制備rAPC單體，參考Liu等[17]的方法，設(shè)置rAPC單體為寬帶泵浦探測(cè)的對(duì)照組。

2.2 光譜特性測(cè)定

用Agilent Cary 60 紫外吸收光譜儀對(duì)rAPC進(jìn)行250～800 nm的全波長(zhǎng)掃描，用Agilent Cary Eclipse熒光光譜儀測(cè)定rAPC的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長(zhǎng)為620 nm。用Chirascan plus的圓二色光譜儀對(duì)rAPC三聚體進(jìn)行180～260 nm的紫外區(qū)掃描以及250～750 nm的可見(jiàn)光區(qū)掃描，光徑均為1 mm。

2.3 時(shí)間分辨光譜探測(cè)

為了探測(cè)rAPC的超快時(shí)間分辨?zhèn)髂苓^(guò)程，自行研制的非共線光參量放大器（NOPA）被用于進(jìn)行寬帶泵浦探測(cè)，NOPA裝置具體參數(shù)參考Zhu等[21]，王云鵬等[22]的方法。NOPA寬帶脈沖覆蓋范圍為550～760 nm，該范圍覆蓋了rAPC的吸收范圍。NOPA的脈沖寬度為11 fs，可用于檢測(cè)大于11 fs的傳能過(guò)程。其泵浦源是光譜中心為800 nm的35 fs摻鈦藍(lán)寶石脈沖激光放大器（Spitfire Ace; Spectra-Physics），重復(fù)頻率為1 kHz。rAPC樣品的最大吸光度OD值控制在0.3～0.4之間，樣品厚度為1 mm。

3 結(jié)果和討論

3.1 rAPC三聚體蛋白表達(dá)、純化及成分鑒定

當(dāng)rAPC在大腸桿菌中被誘導(dǎo)表達(dá)后，如圖2a和圖2b所示，菌體呈現(xiàn)綠色，這是rAPC的藍(lán)色和大腸桿菌的黃色疊加色。收集誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的菌體，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的菌體受表達(dá)的rAPC的顏色影響呈天藍(lán)色，誘導(dǎo)前的菌體依然是大腸桿菌原本的淡黃色。通過(guò)藍(lán)光和綠光對(duì)菌體進(jìn)行激發(fā)，結(jié)果如圖2a所示，誘導(dǎo)前的菌體對(duì)藍(lán)光和綠光均無(wú)反應(yīng)。而誘導(dǎo)后的菌體在藍(lán)光下無(wú)反應(yīng)，但是在綠光下被激發(fā)出紅色的熒光，紅光的光譜區(qū)間位于625～740 nm[23]，這符合APC三聚體可于660 nm處產(chǎn)生熒光發(fā)射的光譜特性[24]，說(shuō)明rAPC誘導(dǎo)表達(dá)成功。

圖2 誘導(dǎo)后菌體的穩(wěn)態(tài)光譜及熒光性質(zhì)變化Fig.2 Steady-state spectra and fluorescence properties of induced bacteria

以誘導(dǎo)前的菌體為基線，對(duì)誘導(dǎo)后的大腸桿菌進(jìn)行全波段穩(wěn)態(tài)吸收光譜掃描，如圖2b所示，在652 nm處有明顯的吸收峰，以600 nm為激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)量菌體的熒光發(fā)射光譜，最大熒光發(fā)射峰位于660 nm處。該結(jié)果符合rAPC三聚體的光譜特征[25]，證明了rAPC在大腸桿菌中被成功的誘導(dǎo)表達(dá)且其表達(dá)的α亞基和β亞基已經(jīng)成功組裝成為三聚體。

通過(guò)不連續(xù)蔗糖密度梯度離心對(duì)rAPC進(jìn)行純化的結(jié)果如圖3a所示。少量rAPC單體位于0.6 mol/L蔗糖分層處，多數(shù)的rAPC三聚體位于0.8 mol/L蔗糖分層處。rAPC三聚體呈天藍(lán)色（圖3b）。蔗糖密度分離結(jié)果說(shuō)明，異源表達(dá)的rAPC多數(shù)可組裝成為三聚體，但是可能由于其兩個(gè)亞基的表達(dá)比例不平衡，或部分亞基組裝有誤導(dǎo)致部分單體不能成功組裝成三聚體。吸取rAPC三聚體進(jìn)行SDS-PAGE蛋白膠鑒定，結(jié)果證實(shí)rAPC三聚體α亞基和β亞基的分子量分別約為 21 kD 和 19 kD（圖3c）[7,26]。

圖3 rAPC三聚體純化及亞基鑒定Fig.3 Purification and composition identification of rAPC trimer

3.2 rAPC三聚體穩(wěn)態(tài)光譜特性

rAPC三聚體的穩(wěn)態(tài)吸收光譜（圖4a）顯示，在可見(jiàn)光區(qū)650 nm處存在1個(gè)特征吸收峰，620 nm及590 nm處存在吸收肩峰，這與二階導(dǎo)數(shù)顯示的吸收峰趨勢(shì)一致。而rAPC單體僅在620 nm處存在一個(gè)吸收峰。二階導(dǎo)數(shù)吸收光譜確認(rèn)吸收峰趨勢(shì)與穩(wěn)態(tài)吸收光譜一致（圖4a）。其中，rAPC三聚體650 nm處的特征吸收峰與天然APC三聚體的吸收光譜一致[14,24,27]。有研究人員認(rèn)為，APC三聚體中的β84PCB通過(guò)與周圍氨基酸的相互作用而導(dǎo)致的吸收光譜紅移至650 nm，而α84PCB則保留原有構(gòu)象，吸收峰依舊為620 nm[28-31]。但也有少數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為，光譜紅移是由于α84PCB的構(gòu)象發(fā)生了變化[25]。但是考慮到β亞基進(jìn)化上更為保守，關(guān)于β亞基構(gòu)象變化的晶體學(xué)數(shù)據(jù)也更加充分，目前多數(shù)觀點(diǎn)支持前者的結(jié)論，且認(rèn)為在rAPC三聚體中能量遵循FRET，可以從α84PCB傳遞至β84PCB。除了FRET能量轉(zhuǎn)移機(jī)制，也有觀點(diǎn)認(rèn)為，吸收峰紅移至650 nm是由于激子耦合理論導(dǎo)致，也就是說(shuō)是由于相鄰單體之間的兩個(gè)發(fā)色團(tuán)之間的距離小于20 ?而發(fā)生的強(qiáng)耦合導(dǎo)致[32-33]。目前公認(rèn)的觀點(diǎn)是，在APC三聚體的能量傳遞過(guò)程中，F(xiàn)RET和激子耦合能量轉(zhuǎn)移共同存在。值得注意的是，rAPC三聚體620 nm處的吸收肩峰，對(duì)比天然APC三聚體，該峰更明顯一些。我們認(rèn)為，這是由于在蛋白溶液中存在少量未組裝成三聚體的單體或由三聚體解聚的游離單體導(dǎo)致。rAPC三聚體在590 nm處的吸收肩峰，雖在其他的數(shù)據(jù)中均也有被觀測(cè)到，但對(duì)于它的解釋較少。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)及其他文章報(bào)道的圓二色（Circular Dichroism, CD）光譜數(shù)據(jù)（詳見(jiàn)3.3節(jié)），我們認(rèn)為，該處可能存在弱耦合的能量傳遞過(guò)程[12-13,20,34]。此外，在近紫外區(qū)340～370 nm附近還存在藻膽素的特征吸收峰[35-36]。

圖4 rAPC單體和三聚體的穩(wěn)態(tài)吸收光譜及熒光發(fā)射光譜Fig.4 Steady-state absorption spectra and fluorescence spectra of rAPC trimer

rAPC單體和三聚體的穩(wěn)態(tài)熒光發(fā)射光譜顯示（圖4b），以600 nm激發(fā)rAPC單體，rAPC單體的最大熒光發(fā)射峰位于640 nm處，而rAPC三聚體的最大熒光發(fā)射峰位于663 nm（圖4），這是APC三聚體的特征熒光發(fā)射峰，證明了rAPC三聚體組裝成功，該結(jié)果與其他報(bào)道一致。在720 nm左右存在一個(gè)熒光發(fā)射肩峰，這被認(rèn)為可能對(duì)應(yīng)1 200 cm-1附近的電子振動(dòng)耦合躍遷[13-14,16]。

3.3 rAPC三聚體圓二色光譜特性

對(duì)rAPC三聚體進(jìn)行CD紫外區(qū)和可見(jiàn)光區(qū)的光譜探測(cè)，設(shè)定rAPC單體為對(duì)照組。紫外區(qū)可反映rAPC的二級(jí)結(jié)構(gòu)的組裝情況，可見(jiàn)光區(qū)則可反映rAPC色基微環(huán)境的變化[37]。

分析rAPC單體及三聚體CD的紫外區(qū)光譜（圖5a），發(fā)現(xiàn)兩者具有一樣的光譜特性，均在209 nm和222 nm處表現(xiàn)出吸收特征，這說(shuō)明rAPC單體組裝成三聚體的過(guò)程不影響蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在CD光譜中，209 nm和222 nm反映的是α螺旋結(jié)構(gòu)，β折疊則反映在216 nm處[38-39]。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了rAPC主要以α螺旋結(jié)構(gòu)為主，不存在β折疊結(jié)構(gòu)。

圖5 rAPC單體和三聚體的CD光譜Fig.5 CD spectra of rAPC monomer and trimer

對(duì)rAPC單體和三聚體CD的可見(jiàn)光區(qū)光譜進(jìn)行探測(cè)發(fā)現(xiàn)（圖5b），rAPC單體CD可見(jiàn)光區(qū)的光譜僅顯示了619 nm處的正峰以及344 nm處的負(fù)峰。相比而言，rAPC三聚體的CD可見(jiàn)光區(qū)光譜則顯示出了更多的峰：659 nm和612～616 nm處存在兩個(gè)正峰，643 nm和343 nm處存在兩個(gè)負(fù)峰，正負(fù)峰交匯，出現(xiàn)了3個(gè)零點(diǎn)：648 nm、635 nm以及530 nm。此外，特別發(fā)現(xiàn)在584～589 nm和625 nm處存在波動(dòng)的小肩峰。這證實(shí)了rAPC從單體組裝成三聚體后色基微環(huán)境變得復(fù)雜。

在天然APC三聚體的CD光譜中，也存在659 nm處的正峰以及643 nm處的負(fù)峰，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符，且其他報(bào)道已通過(guò)解疊法證明它們組成了一對(duì)正負(fù)峰[34,40-41]。多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為，這兩個(gè)峰的存在支持了650 nm處的生色團(tuán)對(duì)由于偶極-偶極相互作用而導(dǎo)致激子分裂的觀點(diǎn)，能量因此躍遷至659 nm以及643 nm波長(zhǎng)處[41]。此外，343 nm處出現(xiàn)的負(fù)峰也較為明顯，該峰對(duì)應(yīng)于穩(wěn)態(tài)吸收光譜340 nm范圍內(nèi)PCB的吸收峰。

需要特別分析的是，本實(shí)驗(yàn)中584～589 nm處和625 nm處為波動(dòng)的小肩峰。而在其他APC三聚體CD光譜的報(bào)道中，589 nm處為負(fù)峰，625 nm處為正峰，且將CD光譜解疊后，這兩個(gè)峰組成了正負(fù)峰對(duì)，有部分觀點(diǎn)認(rèn)為，這個(gè)正負(fù)峰對(duì)是APC三聚體中存在弱耦合色素對(duì)的證據(jù)[34,41]。然而，在本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中，625 nm處的正峰似乎藍(lán)移至612～616 nm處，而589 nm處的負(fù)峰僅表現(xiàn)為一個(gè)小肩峰（圖5b）。考慮到其他多種研究證明的APC三聚體CD光譜的復(fù)雜性[42-43]，我們推測(cè)，這可能是由于不同實(shí)驗(yàn)中生色團(tuán)所處的微環(huán)境的異質(zhì)性導(dǎo)致的CD光譜存在差異，例如本實(shí)驗(yàn)溶液中存在的部分的游離單體（導(dǎo)致620 nm處的吸收肩峰更明顯），可能導(dǎo)致弱耦合信號(hào)更加減弱。此外，結(jié)合吸收光譜，我們認(rèn)為，589 nm處的CD光譜負(fù)峰可能與吸收光譜中590 nm處的吸收峰相對(duì)應(yīng)，因此，590 nm處很可能有弱耦合發(fā)色團(tuán)對(duì)相關(guān)的能量傳遞過(guò)程。綜上，rAPC三聚體的CD光譜基本與天然APC三聚體的CD光譜結(jié)果一致。證明了rAPC三聚體中存在著強(qiáng)耦合的發(fā)色團(tuán)對(duì)，且強(qiáng)耦合導(dǎo)致了激子分裂，該結(jié)果同時(shí)也是rAPC三聚體結(jié)構(gòu)完整性及能量傳遞高效性的一個(gè)輔助證據(jù)。

3.4 rAPC三聚體能量傳遞的寬帶泵浦探測(cè)分析

為了能夠測(cè)量rAPC三聚體在百飛秒內(nèi)的能量傳遞過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)對(duì)rAPC三聚體進(jìn)行了寬帶泵浦探測(cè)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)設(shè)定rAPC單體為對(duì)照組，脈沖覆蓋范圍及樣品吸收光譜如圖6所示。為了避免由于多光子吸收所引起的額外的超快非線性過(guò)程[44]，在進(jìn)行寬帶泵浦探測(cè)之前，先對(duì)rAPC單體和三聚體分別進(jìn)行激發(fā)能量依賴的寬帶泵浦探測(cè)實(shí)驗(yàn)（圖7）。分析動(dòng)力學(xué)早期T等于100 fs時(shí)ΔOD值的變化，可以看到，無(wú)論是rAPC單體或三聚體，在激發(fā)能量密度小于40 μJ/cm2的激發(fā)條件下都隨著激發(fā)能量密度呈線性變化。但特別的，當(dāng)三聚體的能量密度超過(guò)70 μJ/cm2時(shí)，ΔOD不再是線性變化，有可能是出現(xiàn)了多光子吸收的過(guò)程[44]，這將影響后續(xù)的光譜分析，因此實(shí)驗(yàn)所采用的激發(fā)能量密度均小于 40 μJ/cm2。

圖6 NOPA脈沖覆蓋范圍及rAPC單體和三聚體穩(wěn)態(tài)吸收光譜Fig.6 Coverage of NOPA pulse and steady-state absorption spectra of rAPC trimer

圖7 rAPC單體及三聚體的激發(fā)能量依賴Fig.7 Excitation energy dependence of rAPC monomer and trimer

對(duì)寬帶泵浦探測(cè)結(jié)果進(jìn)行動(dòng)力學(xué)擬合。在rAPC單體在620 nm處擬合出3個(gè)時(shí)間壽命常數(shù)，分別為(57±10) fs、(7.4±4.8) ps以及 400 ps；rAPC 三聚體在 620 nm處擬合出3個(gè)時(shí)間壽命常數(shù)，分別為(19±7) fs、(630±100) fs以及400 ps；在656 nm處擬合出兩個(gè)時(shí)間壽命常數(shù)，分別為 (470±100) fs以及 400 ps（表1）。rAPC單體(57±10) fs和(7.4±4.8) ps兩個(gè)壽命常數(shù)被認(rèn)為對(duì)應(yīng)于單體的快速溶劑化過(guò)程，這與8a圖中單體由于溶劑化而光譜紅移并伴隨動(dòng)力學(xué)衰減的結(jié)果相一致[45-46]。而 rAPC 三聚體 (19±7) fs以及 (630±100) fs兩個(gè)時(shí)間常數(shù)被認(rèn)為對(duì)應(yīng)于三聚體的能量傳遞過(guò)程，將在后面做細(xì)致的討論。其中最后一個(gè)壽命（400 ps）為固定的壽命參數(shù)，因?yàn)槌隽藢?shí)驗(yàn)所采集的時(shí)間范圍（100 ps）。

表1 rAPC單體和三聚體瞬態(tài)吸收動(dòng)力學(xué)擬合常數(shù)Table 1 The fitting constants of rAPC trimer transient absorption dynamics

19 fs的超短時(shí)間常數(shù)與其他文獻(xiàn)中報(bào)道的10～60 fs的時(shí)間常數(shù)相一致，這樣短的傳能時(shí)間通常被認(rèn)為與相干過(guò)程有關(guān)，該時(shí)間常數(shù)在其他報(bào)道中被指認(rèn)為是兩個(gè)PCB分子組成的激子對(duì)的電子退相干時(shí)間[12-14,27]。考慮到本次實(shí)驗(yàn)的脈沖寬度為11 fs，檢測(cè)到19 fs的電子退相干時(shí)間是有可能的[47]。但是該時(shí)間常數(shù)所代表的具體相干過(guò)程目前還沒(méi)有研究進(jìn)行細(xì)致的報(bào)道，關(guān)于相干傳能過(guò)程的具體研究還需要后續(xù)借助于高分辨率的二維時(shí)間分辨光譜技術(shù)來(lái)完成[48]。470～630 fs的時(shí)間常數(shù)我們認(rèn)為是能量在620 nm和656 nm這兩個(gè)吸收峰代表的色素之間無(wú)輻射衰減的過(guò)程。這與寬帶泵浦探測(cè)的其他動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果相一致。如圖8b所示，對(duì)比rAPC單體（圖8a），600 fs內(nèi)rAPC三聚體在656 nm處表現(xiàn)了顯著的能量增長(zhǎng)，而在620 nm處表現(xiàn)出能量弛豫（圖8b），這證實(shí)了三聚體中能量從620 nm向650 nm傳遞的過(guò)程。

圖8 rAPC三聚體及單體的瞬態(tài)探測(cè)Fig.8 Transients detected of rAPC trimer and monomer

截取不同時(shí)間分辨率下的寬帶泵浦探測(cè)光譜進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析（圖9b），其中光譜中的負(fù)峰表示基態(tài)漂白和受激發(fā)射的信號(hào)貢獻(xiàn)，而正峰表示激發(fā)態(tài)吸收過(guò)程。在T等于104 fs時(shí)的光譜中明顯的干涉信號(hào)是由于樣品對(duì)激發(fā)光的散射造成的。結(jié)果顯示，rAPC三聚體在0～600 fs的過(guò)程中，618～625 nm范圍內(nèi)的負(fù)峰逐漸減弱，這反映了能量從620 nm傳遞至650 nm的過(guò)程幾乎在600 fs以內(nèi)完成。但與其他報(bào)道不同的是，在本實(shí)驗(yàn)中655～658 nm處的信號(hào)基本保持不變，而不是信號(hào)顯著增長(zhǎng)。這是因?yàn)樵谄渌麍?bào)道中泵浦探測(cè)用的是窄帶激發(fā)脈沖，因此650 nm處的信號(hào)僅反映了由620 nm傳遞過(guò)去的能量[27]。而本實(shí)驗(yàn)采用的寬帶脈沖可以直接激發(fā)650 nm。對(duì)比rAPC單體的瞬態(tài)光譜變化（圖9a），發(fā)現(xiàn)rAPC單體625.5 nm處的負(fù)峰紅移至633 nm，該紅移過(guò)程被認(rèn)為是由于溶劑化過(guò)程導(dǎo)致[49]。但紅移現(xiàn)象在三聚體中并不明顯（僅紅移3 nm），這可能是由于三聚體中色基之間存在強(qiáng)耦合使溶劑化過(guò)程減弱。

rAPC三聚體不同時(shí)間下瞬態(tài)光譜結(jié)果顯示了三聚體的整體傳能過(guò)程（圖9b），激發(fā)0 fs后的瞬態(tài)光譜形狀對(duì)比穩(wěn)態(tài)光譜基本沒(méi)有改變：在650 nm左右處有銳利的特征吸收峰，并伴隨著較弱的590 nm和較強(qiáng)的620 nm的肩峰信號(hào)（圖9b）以及680 nm處的正峰信號(hào)。655～658 nm處銳利的峰形符合強(qiáng)激子耦合的光譜特征。在590～600 nm范圍內(nèi)，始終存在的負(fù)吸收信號(hào)與吸收光譜結(jié)果一致。結(jié)合吸收光譜的結(jié)果分析，我們認(rèn)為，此處可能存在弱耦合的色素對(duì)。但由于寬帶泵浦探測(cè)光譜的動(dòng)力學(xué)分析并沒(méi)有與此相關(guān)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，且600 fs內(nèi)，600 nm左右的泵浦探測(cè)光譜波動(dòng)較大，因此無(wú)法確定傳能過(guò)程。但考慮到該峰并不存在于rAPC單體中（圖9a），590～600 nm范圍內(nèi)的負(fù)峰被認(rèn)為可能與三聚體的能量傳遞有關(guān)。此外，rAPC三聚體的泵浦探測(cè)光譜顯示，穩(wěn)定存在著一個(gè)680 nm的正信號(hào)，該信號(hào)在rAPC單體的寬帶泵浦探測(cè)光譜中也一直存在。已有其他文獻(xiàn)報(bào)道[27]，該信號(hào)對(duì)應(yīng)于第一激發(fā)態(tài)往更高的電子激發(fā)態(tài)躍遷所產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)吸收過(guò)程。另外，在三聚體中還可能包含了激子耦合所產(chǎn)生的雙激子態(tài)所造成的激發(fā)態(tài)吸收過(guò)程。

圖9 rAPC單體及三聚體不同時(shí)間下的瞬態(tài)光譜變化Fig.9 Energy transfer dynamics of rAPC monomer and trimer at several delay times

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)rAPC三聚體在室溫下進(jìn)行了多種光譜探測(cè)，并設(shè)立rAPC單體為對(duì)照組，這些光譜在不同的光譜分辨率下反映了rAPC三聚體的傳能過(guò)程。

其中，穩(wěn)態(tài)光譜結(jié)果證明，rAPC三聚體具有和天然APC一樣的光譜特性，這些特性由三聚體獨(dú)特的蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的獨(dú)特的生色團(tuán)微環(huán)境決定，因此，光譜特性一定程度上反映了rAPC三聚體的蛋白結(jié)構(gòu)。而CD光譜證明了rAPC單體組裝成rAPC三聚體時(shí)，并不改變蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但是會(huì)影響發(fā)色團(tuán)的微環(huán)境。同時(shí)CD光譜證實(shí)了650 nm處激發(fā)態(tài)的激子分裂情況，這是證明rAPC三聚體發(fā)色團(tuán)及蛋白結(jié)構(gòu)特性的另一有力證據(jù)。但是由于環(huán)境異質(zhì)性，在CD光譜中我們并沒(méi)有看到弱耦合對(duì)的存在。

寬帶泵浦探測(cè)光譜的動(dòng)力學(xué)結(jié)果證實(shí)了rAPC三聚體中存在300～600 fs時(shí)間尺度的620～650 nm的傳能過(guò)程，且該過(guò)程不存在于rAPC單體中。這證明了rAPC三聚體的結(jié)構(gòu)完整性，且傳能過(guò)程與天然APC一致。此外，我們還測(cè)到了19 fs的超短壽命常數(shù)，這和其他研究報(bào)道的可能的激子態(tài)的電子退相干時(shí)間基本一致。值得注意的是，590 nm處的激發(fā)態(tài)在傳能動(dòng)力學(xué)過(guò)程中也一直存在。然而，該激發(fā)態(tài)的來(lái)源和去向我們并不能清晰的判斷，但在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們將利用二維電子光譜等技術(shù)，繼續(xù)深入研究該激發(fā)態(tài)與弱耦合色素對(duì)相關(guān)的能量傳遞之間的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)結(jié)合多種光譜學(xué)手段，對(duì)rAPC的能量傳遞過(guò)程進(jìn)行了探測(cè)，這為闡明APC傳能的本質(zhì)，揭示藻膽體的高效能量傳遞機(jī)制提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。