熊　冰，吳小娟，黃文紅

(華潤(rùn)武鋼總醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢 430080)

?

·臨床研究·

146株流感嗜血桿菌的分離培養(yǎng)與耐藥分析

熊冰，吳小娟，黃文紅

(華潤(rùn)武鋼總醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢 430080)

摘要:目的了解住院患者呼吸道標(biāo)本培養(yǎng)中流感嗜血桿菌(HIN)的培養(yǎng)分離檢出情況，同時(shí)結(jié)合藥物敏感試驗(yàn)分析耐藥情況。方法使用哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，巧克力萬古瓊脂培養(yǎng)基結(jié)合革蘭染色圖片分離疑似流感嗜血桿菌，挑選可疑菌落進(jìn)行衛(wèi)星試驗(yàn)和Ⅴ、Ⅹ、Ⅴ+Ⅹ因子需求試驗(yàn)進(jìn)行鑒定分離。用Nitrocefin 紙片法測(cè)定其β-內(nèi)酰胺酶，采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)測(cè)定藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果，依照CLSI2012版標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果，利用WHONET 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。結(jié)果146株流感嗜血桿菌培養(yǎng)陽性標(biāo)本直接涂片鏡檢均為合格標(biāo)本，β-內(nèi)酰胺酶陽性的流感嗜血桿菌檢出率為32.6%(48/146)。146株流感嗜血桿菌對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑、氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、頭孢呋辛、亞胺培南、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、左氧氟沙星的耐藥率分別為64.4%、44.5%、17.1%、9.0%、0.0%、5.5%、2.7%、4.1%。β-內(nèi)酰胺酶陽性的流感嗜血桿菌的耐藥率明顯高于β-內(nèi)酰胺酶陰性株。結(jié)論實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)重視提高流感嗜血桿菌分離率。β-內(nèi)酰胺酶是流感嗜血桿菌耐藥的主要機(jī)制，其耐藥問題不容忽視，應(yīng)定期統(tǒng)計(jì)其藥物敏感試驗(yàn)數(shù)據(jù)，為臨床使用抗菌藥物提供指導(dǎo)依據(jù)。

關(guān)鍵詞:流感嗜血桿菌；分離培養(yǎng)；β-內(nèi)酰胺酶；耐藥性

流感嗜血桿菌是一類無動(dòng)力、無芽孢的革蘭陰性小桿菌，是社區(qū)獲得性呼吸道感染的主要病原菌之一，也可侵入血液、皮膚黏膜引起腦膜炎、肺炎及敗血癥等嚴(yán)重感染。流感嗜血桿菌屬于苛氧菌，對(duì)其的分離培養(yǎng)反映著實(shí)驗(yàn)室的鑒定水平；近年來，由于抗菌藥物的過度使用，其耐藥率不斷升高。為了解本院各科室呼吸道標(biāo)本中流感嗜血桿菌的分離檢出情況和耐藥狀況，本文將對(duì)本科室2013年1月至2014年12月流感嗜血桿菌的分離培養(yǎng)與耐藥情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1資料與方法

1.1標(biāo)本來源選擇本院2013年1月至2014年12月住院患者合格的呼吸道疑似標(biāo)本395例，包括自然咳痰200例、導(dǎo)管吸痰130例、纖支鏡毛刷刷取物35例、肺泡灌洗液30例等。其中330例來自于成人標(biāo)本，年齡19～71歲、平均(45±26)歲；65例來自于兒童標(biāo)本，年齡3～14歲、平均(8±5.5)歲。

1.2試劑血平板、巧克力平板(含0.5 mg/mL萬古霉素)、水解酪蛋白(MH)培養(yǎng)基、HTM藥物敏感試驗(yàn)培養(yǎng)基均由廣州迪景公司提供。Ⅴ、Ⅹ、Ⅴ+Ⅹ因子，復(fù)方磺胺甲噁唑、氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、頭孢呋辛、亞胺培南、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、左氧氟沙星藥物敏感試驗(yàn)紙片均購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司。

1.3標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923、流感嗜血桿菌ATCC10211。

1.4方法

1.4.1菌株的分離與鑒定將收到的送檢標(biāo)本同時(shí)接種于血平板和巧克力平板，37 ℃ CO2培養(yǎng)缸24 h培養(yǎng)后，挑取血平板上不長(zhǎng)，巧克力平板上的透明或半透明、扁平、濕潤(rùn)的露滴狀菌落涂片染色[1]，革蘭陰性桿菌列為疑似菌落重新轉(zhuǎn)種于巧克力平板，置37 ℃ CO2培養(yǎng)缸培養(yǎng)24 h后，挑取單個(gè)菌落配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，均勻涂布在MH瓊脂表面和血平板表面，置室溫干燥3～5 min，血平板上點(diǎn)種金黃色葡萄球菌進(jìn)行衛(wèi)星現(xiàn)象試驗(yàn)，MH培養(yǎng)基貼Ⅴ因子、Ⅹ因子、Ⅴ+Ⅹ因子紙片，紙片間距24 mm，置37 ℃ CO2培養(yǎng)缸培養(yǎng)24 h后觀察。血平板上衛(wèi)星試驗(yàn)陽性同時(shí)不溶血的菌落，MH平板上同時(shí)需要Ⅴ因子、Ⅹ因子均為陽性的鑒定為流感嗜血桿菌。

1.4.2藥物敏感試驗(yàn)試驗(yàn)挑取鑒定合格的菌落，以流感嗜血桿菌ATCC10211為質(zhì)控菌株，采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)分別進(jìn)行復(fù)方磺胺甲噁唑、氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、頭孢呋辛、亞胺培南、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、左氧氟沙星8種抗菌藥物的敏感性測(cè)定，按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2012版[2]的判定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量抑菌圈直徑，以及判定耐藥和敏感。

1.4.3β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)采用頭孢硝噻酚法，在頭孢硝噻酚紙片上加1滴無菌生理鹽水，紙片浸濕后將菌落涂布于紙片上，10 min 內(nèi)變紅表示為β-內(nèi)酰胺酶陽性菌株。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用WHONET5.6對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果

2.1流感嗜血桿菌的分離培養(yǎng)情況395例疑似標(biāo)本均為合格非重復(fù)標(biāo)本，共分離出流感嗜血桿菌146株，均來自于住院患者痰標(biāo)本。其中10歲以下兒童患者分離出56株，占38.4%；20～50歲患者分離出10株，占6.4%；60歲以上患者分離出80株，占54.8%。

表1　　146株流感嗜血桿菌對(duì)8種抗菌藥物的

續(xù)表1　　146株流感嗜血桿菌對(duì)8種抗菌藥物的

2.2藥物敏感試驗(yàn)分析146株流感嗜血桿菌對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑、氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、頭孢呋辛、亞胺培南、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、左氧氟沙星的耐藥率分別為64.4%、44.5%、17.1%、9.0%、0.0%、5.5%、2.7%、4.1%。

2.3β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)146株流感嗜血桿菌β-內(nèi)酰胺酶陽性株共檢出48株(32.6%)，產(chǎn)酶株與不產(chǎn)酶株的耐藥率見表1。

3討論

流感嗜血桿菌較廣泛地寄居于健康人上呼吸道，通常以冬季帶菌率較高，發(fā)病也增多，可引起人類原發(fā)性化膿性感染，也可引起繼發(fā)性感染[3]。原發(fā)性感染由b型莢膜強(qiáng)毒株引起，為急性化膿感染，如腦膜炎、鼻咽炎、心包炎、敗血癥等，以小兒多見。繼發(fā)性感染主要在流感、麻疹、百日咳、肺結(jié)核等感染后發(fā)生，多為無莢膜菌株引起，如慢性支氣管炎、中耳炎、鼻竇炎等，多見于成年人。本研究中146例分離株均來自痰標(biāo)本，說明流感嗜血桿菌主要引起上呼吸道感染。國(guó)外也有文獻(xiàn)報(bào)道流感嗜血桿菌引起泌尿生殖道炎癥，陽性率不高卻有著重要意義[4]，國(guó)內(nèi)類似報(bào)道少見，這可能與流感嗜血桿菌的營(yíng)養(yǎng)要求較高、普通血瓊脂平板上不易生長(zhǎng)有關(guān)。流感嗜血桿菌的生長(zhǎng)需要Ⅴ、Ⅹ因子，且在5%～10% CO2條件下才能生長(zhǎng)，因此本研究采用加入萬古霉素的巧克力平板來分離臨床標(biāo)本中的流感嗜血桿菌，加入0.5 mg/mL萬古霉素抑制革蘭陽性菌株和其他細(xì)菌的生長(zhǎng)。

由于兒童及老年人的抵抗力較弱，所以比較容易感染此菌，近年來，流感嗜血桿菌的感染率呈上升趨勢(shì)，其分離鑒定對(duì)臨床診斷有較高的參考意義，因此各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)重視對(duì)其的培養(yǎng)檢出。

由于抗菌藥物的過度使用，流感嗜血桿菌的耐藥率與耐藥范圍也在逐步擴(kuò)大。本研究中對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑的敏感性已不足40%，該藥不再適合臨床使用；氨芐西林的耐藥率有44.5%，而產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶株的耐藥率更是達(dá)到了100.0%，這說明產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林耐藥的主要機(jī)制。青霉素類抗菌藥物原為治療流感嗜血桿菌的首選藥物，但是由于臨床濫用抗菌藥物，而導(dǎo)致氨芐西林的耐藥株不斷增多，給診斷和治療帶來一定的困難，這與桂和翠等[5]的研究報(bào)道結(jié)果一致。流感嗜血桿菌對(duì)氨芐西林的耐藥機(jī)制主要是菌株產(chǎn)生質(zhì)粒介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶，其中90%以上為TEM-1型基因，少數(shù)為ROB-1型基因所編碼，β-內(nèi)酰胺酶水解了氨芐西林分子結(jié)構(gòu)上的β-內(nèi)酰胺環(huán)，使氨芐西林失去活性而耐藥。而β-內(nèi)酰胺酶陰性株則主要是由染色體介導(dǎo)的青霉素結(jié)合蛋白的改變和細(xì)胞膜對(duì)抗菌劑通透性的改變引起，因此氨芐西林已不適用于臨床應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)室分離出的β-內(nèi)酰胺酶陽性株占總株數(shù)的32.6%。

其他抗菌藥物頭孢呋辛、亞胺培南、頭孢噻肟、左氧氟沙星均較敏感，耐藥率較低，不超過10%，與趙蕾[6]的報(bào)道結(jié)果一致，因此在本院治療流感嗜血桿菌引起的呼吸道感染時(shí)，可優(yōu)先選用頭孢呋辛、左氧氟沙星，必要時(shí)使用頭孢噻肟、亞胺培南。隨著抗菌藥物的用量和時(shí)間的關(guān)系，流感嗜血桿菌的耐藥性可能會(huì)發(fā)生改變，因此用藥過程中應(yīng)定期進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，尤其是對(duì)兒童患者和60歲以上中老年患者，調(diào)整抗菌藥物的種類和用量。微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)重視和加強(qiáng)流感嗜血桿菌的培養(yǎng)及耐藥性監(jiān)測(cè)工作以指導(dǎo)臨床醫(yī)生合理使用抗菌藥物。

參考文獻(xiàn)

[1]葉應(yīng)嫵，王毓三.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M].2版.南京：東南大學(xué)出版社，1997：501-511.

[2]Clinical and Laboratory Standards Institute.M100-S22 Performance standards for antimicrobial.susceptibility testing；twenty-secdond informational supplement[S].Wayne，PA，USA：CLSI，2012：96-99.

[3]朱旭慧，孫自鏞，李麗，等.流感嗜血桿菌的分布及耐藥性分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2010,28(2):114-116.

[4]Vazquez F,Andres MT,Palacio V,et al.Isolation of haemophilus influenzae and Haemophilus parainfluenzae in genitourinary infections:a 4-year review[J].Enferm Infecc Microbiol Clin，1996，14(3):181-185.

[5]桂和翠，王中新，沈繼錄.48株流感嗜血桿菌耐藥性分析及β-內(nèi)酰胺酶基因檢測(cè)[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47(1):56-59.

[6]趙蕾.57株流感嗜血桿菌的耐藥性分析及分布[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志2013,7(4)：527-529.

(收稿日期：2015-12-20)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.032

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)06-0792-03