王　楠，潘　喆，袁　宏

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.病理科，遼寧大連 116023)

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·論著·

抑制性差減雜交技術(shù)分離白血病多藥耐藥基因

王楠1，潘喆2△，袁宏1

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.病理科，遼寧大連 116023)

摘要:目的分離及鑒定與白血病多藥耐藥性相關(guān)的差異表達(dá)基因。方法采用抑制性差減雜交(SSH)技術(shù)分離非耐藥細(xì)胞株K562與耐藥細(xì)胞株K562/DOX差異表達(dá)基因。提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶RsaⅠ酶切后，分別與不同的接頭(adopter1和adopter2R)連接；連接產(chǎn)物插入pMD19-T載體后轉(zhuǎn)入大腸埃希菌中，構(gòu)建cDNA差減文庫(kù)；挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序及同源序列分析，確定差異表達(dá)基因。結(jié)果篩選獲得220個(gè)差異表達(dá)基因，包括血紅蛋白、核糖體和線粒體等相關(guān)基因，以及熱休克因子結(jié)合蛋白(HSPB1)基因等其他基因。結(jié)論采用SSH技術(shù)及分子克隆技術(shù)可構(gòu)建耐藥及非耐藥腫瘤細(xì)胞株差異表達(dá)基因的差減cDNA文庫(kù)，能夠?yàn)檫M(jìn)一步篩選、克隆腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性相關(guān)差異表達(dá)基因奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:白血??；多藥耐藥；抑制性差減雜交；差異表達(dá)基因

白血病細(xì)胞多藥耐藥是導(dǎo)致化療效果減低或治療無效的主要原因，而耐藥基因過度表達(dá)是腫瘤細(xì)胞形成耐藥性的基礎(chǔ)。研究白血病耐藥細(xì)胞基因表達(dá)的差異，可獲知細(xì)胞出現(xiàn)表型差異的原因，提供復(fù)雜生命過程的基本信息[1]。本研究采用抑制性差減雜交(SSH)技術(shù)構(gòu)建非耐藥白血病細(xì)胞株K562與耐藥細(xì)胞株K562/DOX差異表達(dá)基因的cDNA文庫(kù)[2]，為篩選白血病耐藥基因，揭示白血病多藥耐藥的形成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞株白血病細(xì)胞株K562由大連醫(yī)科大學(xué)血液檢驗(yàn)研究所惠贈(zèng)，耐藥細(xì)胞株K562/DOX購(gòu)自天津血液病研究所。所有細(xì)胞均按常規(guī)方法培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，1～2 d換液1次使細(xì)胞維持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)。K562/DOX細(xì)胞株定期采用阿霉素沖擊以維持其耐藥性(阿霉素應(yīng)用劑量為10 μg/mL，1小時(shí)/次，1次/周)。停藥2周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2試劑SMARTer cDNA合成試劑盒(SMARTer cDNA Synthesis Kit，批號(hào)：634925)、SSH試劑盒(PCR-Select cDNA Subtraction試劑盒，批號(hào)：637401)、DNA片段純化試劑盒(DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0，批號(hào)：DV807)、DNA連接試劑盒(DNA Ligation Kit，批號(hào)：D6020A)、pMD19-T載體(pMD19-T Vector，批號(hào)：D102A)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3方法

1.3.1cDNA合成及確認(rèn)最佳PCR產(chǎn)物以2 μL細(xì)胞總RNA作為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR反應(yīng)條件：72 ℃ 3 min，42 ℃ 2 min。為獲得較高濃度產(chǎn)物和確認(rèn)最佳PCR產(chǎn)物，進(jìn)行一系列PCR擴(kuò)增，以電泳結(jié)果確認(rèn)最佳產(chǎn)物。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，循環(huán)次數(shù)分別為15、18、21、24、27次。采用1%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)電泳結(jié)果確認(rèn)最佳循環(huán)次數(shù)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化處理，電泳確認(rèn)純化效果。

1.3.2cDNA酶切及確認(rèn)采用限制性內(nèi)切酶RsaⅠ對(duì)K562細(xì)胞及K562/DOX細(xì)胞cDNA進(jìn)行酶切，反應(yīng)體系為最佳產(chǎn)物cDNA 300 μL，10×RsaⅠ酶切緩沖液36 μL，RsaⅠ 1.5 μL，反應(yīng)條件為37 ℃ 3 h。采用1%瓊脂糖凝膠對(duì)10 μL未酶切的cDNA和10 μL RsaⅠ酶切后的cDNA進(jìn)行電泳，同時(shí)加入8 μL 乙二胺四乙酸/糖原混合物終止反應(yīng)，2%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)產(chǎn)物。

1.3.3連接反應(yīng)以人骨骼肌細(xì)胞DNA作為對(duì)照組(Control組)，將2 μL DNA加入38 μL dH2O中，DNA終濃度為150 ng/mL。以K562/DOX細(xì)胞DNA作為檢測(cè)組(Tester組)，取RsaⅠ酶切后的cDNA產(chǎn)物進(jìn)行5倍稀釋。根據(jù)接頭(adaptor)的差異分為4個(gè)亞組，分別為K562/DOX Tester1-1組、K562/DOX Tester1-2組、Control Tester1-1組和Control Tester1-2組。為檢測(cè)連接是否正常，加入1 μL 20 乙二胺四乙酸/糖原混合物終止反應(yīng)，72 ℃預(yù)熱5 min，反應(yīng)體系為cDNA 2 μL，T4 DNA連接酶1 μL，adaptor1/adaptor2R 2 μL；反應(yīng)條件為94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 2.5 min，共25個(gè)循環(huán)，電泳確認(rèn)反應(yīng)結(jié)果。

1.3.4差減雜交反應(yīng)將RsaⅠ酶切處理的cDNA分別與連接產(chǎn)物進(jìn)行第1輪雜交；反應(yīng)條件：98 ℃ 90 s，68 ℃ 8 h。將第1輪雜交產(chǎn)物混合進(jìn)行第2輪雜交；反應(yīng)條件：98 ℃ 90 s，68 ℃過夜。

1.3.5PCR擴(kuò)增反應(yīng)第1次PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為雜交產(chǎn)物/未雜交產(chǎn)物/Control雜交產(chǎn)物/陰性對(duì)照品各1 μL，10×含Mg2+的AdvantageTMPCR緩沖液2.5 μL，50×dNTP混合物(每種dNTP濃度為10 mmol/L)0.5 μL，50×AdvantageTM聚合酶混合液(2.5 U/μL)0.5 μL，PCR引物1(10 μmol/L)1 μL；反應(yīng)條件：75 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，66 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共27個(gè)循環(huán)，電泳確認(rèn)PCR產(chǎn)物。為富集PCR產(chǎn)物，取1 μL稀釋后的第1次PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行第2次PCR反應(yīng)。

1.3.6陽(yáng)性克隆篩選與確認(rèn)采用DNA片段純化試劑盒精制第2次PCR反應(yīng)產(chǎn)物，命名為CTD809 PCR，使用DNA連接試劑盒對(duì)CTD809 PCR與pMD19-T 載體進(jìn)行連接；連接產(chǎn)物經(jīng)熱轉(zhuǎn)化大腸埃希菌后涂布平板，37 ℃培養(yǎng)過夜；挑選單克隆菌落篩選陽(yáng)性克?。惶崛￡?yáng)性克隆菌落質(zhì)粒，由寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序；采用Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，確認(rèn)差減雜交文庫(kù)是否構(gòu)建成功。

2結(jié)果

2.1cDNA合成及確認(rèn)最佳PCR產(chǎn)物對(duì)循環(huán)次數(shù)分別為15、18、21、24、27次的反應(yīng)產(chǎn)物各5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳(見圖1)，確認(rèn)最佳循環(huán)次數(shù)為15次。

M：1 Kb DNA Ladder分子標(biāo)記物；1～5：K562細(xì)胞cDNA合成產(chǎn)物；6～10：K562/DOX細(xì)胞cDNA合成產(chǎn)物；11～15：小鼠cDNA合成產(chǎn)物。

圖1PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2cDNA酶切及確認(rèn)采用限制性內(nèi)切酶RsaⅠ對(duì)cDNA產(chǎn)物進(jìn)行酶切，產(chǎn)生末端平頭的片段。將未酶切和酶切的產(chǎn)物各10 μL進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳(見圖2)。

M：1 Kb DNA Ladder分子標(biāo)記物；1：K562細(xì)胞cDNA未酶切產(chǎn)物；2：K562細(xì)胞cDNA RsaⅠ酶切產(chǎn)物；3：K562/DOX細(xì)胞cDNA未酶切產(chǎn)物；4：K562/DOX細(xì)胞cDNA RsaⅠ酶切產(chǎn)物；5：小鼠cDNA未酶切產(chǎn)物；6：小鼠cDNA RsaⅠ酶切產(chǎn)物。

圖2RsaⅠ酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果

M3：ФX174 HaeⅢ酶切產(chǎn)物；1：Tester1-1 PCR產(chǎn)物(小鼠)；2：G3PDH 3′Primer PCR產(chǎn)物(小鼠)；3：Tester1-2 PCR產(chǎn)物(小鼠)；4：G3PDH 5′Primer PCR產(chǎn)物(小鼠)；M：DL2000 DNA分子標(biāo)記物。

圖3連接反應(yīng)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

M3：ФX174 HaeⅢ酶切產(chǎn)物；5：Tester1-1 PCR產(chǎn)物(K562/DOX細(xì)胞)；6：G3PDH 3′Primer PCR產(chǎn)物(K562/DOX細(xì)胞)；7：Tester1-2 PCR產(chǎn)物(K562/DOX細(xì)胞)；8：G3PDH 5′Primer PCR產(chǎn)物(K562/DOX細(xì)胞)；M：DL2000 DNA分子標(biāo)記物。

圖4檢測(cè)反應(yīng)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3連接反應(yīng)Control組和檢測(cè)組標(biāo)本分別連接不同的cDNA adaptor(即adaptor1和adaptor2R)。adaptor的末端無磷酸基團(tuán)，僅有adaptor的1條鏈與cDNA 5′末端相連，adaptor1和adaptor2R具有不同的序列，因此當(dāng)殘留末端被補(bǔ)平后，可同時(shí)與2個(gè)不同的PCR引物進(jìn)行退火連接反應(yīng)。為檢測(cè)連接效率，將產(chǎn)物各5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳(見圖3、4)。電泳結(jié)果表明連接效率大于25%，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

2.4PCR擴(kuò)增在第1次PCR擴(kuò)增中，兩端連接有不同adaptor的差異表達(dá)序列能夠進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，僅有一端連接adaptor或兩端連接同一adaptor形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)時(shí)，只能進(jìn)行線性擴(kuò)增，沒有引物結(jié)合位點(diǎn)則不能進(jìn)行擴(kuò)增。第1次PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(見圖5)顯示，Control組與Tester組雜交PCR產(chǎn)物大小分別為720、900 bp。第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物豐度低，為了富集產(chǎn)物進(jìn)行第2次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果(見圖6)顯示產(chǎn)物豐度明顯增加，陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物條帶明顯，陰性對(duì)照無擴(kuò)增產(chǎn)物。

M：ФX174 HaeⅢ酶切產(chǎn)物；1：Control組PCR產(chǎn)物(雜交)；2：Control組PCR產(chǎn)物(未雜交)；3：Control組PCR產(chǎn)物(陽(yáng)性對(duì)照)；4：Control組PCR產(chǎn)物(陰性對(duì)照)；5：Tester組PCR產(chǎn)物(雜交)；6：Tester組PCR產(chǎn)物(未雜交)；7：Tester組PCR產(chǎn)物(陽(yáng)性對(duì)照)；8：Tester組PCR產(chǎn)物(陰性對(duì)照)。

圖5第1次PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

M：ФX174 HaeⅢ酶切產(chǎn)物；1：Control組PCR產(chǎn)物(雜交)；2：Control組PCR產(chǎn)物(未雜交)；3：Control組PCR產(chǎn)物(陽(yáng)性對(duì)照)；4：Control組PCR產(chǎn)物(陰性對(duì)照)；5：Tester組PCR產(chǎn)物(雜交)；6：Tester組PCR產(chǎn)物(未雜交)；7：Tester組PCR產(chǎn)物(陽(yáng)性對(duì)照)；8：Tester組PCR產(chǎn)物(陰性對(duì)照)。

圖6第2次PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.5陽(yáng)性克隆篩選及確認(rèn)挑選24個(gè)單克隆菌落進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示，在15個(gè)具有插入片段的陽(yáng)性克隆中共有220個(gè)差異基因。經(jīng)Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，選出覆蓋率90%和相似度98%以上的差異基因122個(gè)，舍去98個(gè)覆蓋率和相似度較小的差異基因。在選出的122個(gè)差異基因中，包括34個(gè)線粒體相關(guān)基因、10個(gè)甘油三磷酸脫氫酶基因、4個(gè)核糖體基因、3個(gè)支原體基因、7個(gè)血紅蛋白(HBE1)基因、1個(gè)凝血因子Ⅷ基因、1個(gè)熱休克因子結(jié)合蛋白1(HSBP1)基因和62個(gè)未知基因。

3討論

腫瘤細(xì)胞耐藥基因的存在不但影響化療效果，也影響患者預(yù)后。耐藥基因的表達(dá)是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性的分子基礎(chǔ)。因此，鑒定耐藥細(xì)胞和非耐藥細(xì)胞間的差異基因是闡明耐藥性發(fā)生機(jī)制的重要手段。本研究選用遺傳背景相同的非耐藥K562細(xì)胞與K562/DOX耐藥細(xì)胞，經(jīng)SSH篩選得到相關(guān)差異基因，部分差異基因具有生物學(xué)功能，在腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性方面具有更大的作用。

較高濃度水平的cDNA是順利完成SSH實(shí)驗(yàn)的必備條件，而本研究中的限制性酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，逆轉(zhuǎn)錄合成的K562/DOX和K562細(xì)胞cDNA水平無法滿足SSH實(shí)驗(yàn)的要求。因此，本研究采用PCR擴(kuò)增富集的方法使cDNA水平達(dá)到300 ng/μL。此外，本研究將cDNA合成條件分別設(shè)定為15、18、21、24、27次循環(huán)，合成產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示15次循環(huán)得到的cDNA產(chǎn)物濃度水平最高，為最佳循環(huán)次數(shù)。而在選擇陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，最初選擇了可應(yīng)用于SSH實(shí)驗(yàn)的小鼠總RNA，但PCRC產(chǎn)物電泳圖顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想，推測(cè)原因可能是受到種系同源性因素的影響。因此，本研究選用人骨骼肌細(xì)胞cDNA作為陽(yáng)性對(duì)照。

在應(yīng)用SSH技術(shù)后，本研究選擇24個(gè)單克隆菌落進(jìn)行質(zhì)粒測(cè)序，在15個(gè)有插入片段的陽(yáng)性克隆中共獲得220個(gè)差異基因。經(jīng)Gene Bank比對(duì)分析，選出覆蓋率為90%和相似度為98%以上差異基因122個(gè)，其中線粒體相關(guān)基因共34個(gè)，包括22個(gè)線粒體基因、11個(gè)人類離子細(xì)胞內(nèi)通道蛋白(CLIC2)基因、1個(gè)電位依賴性離子通道3(VDAC3)基因。線粒體基因在多藥耐藥腫瘤細(xì)胞和非耐藥腫瘤細(xì)胞間呈明顯的差異表達(dá)，提示線粒體基因的表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性密切相關(guān)。

電位依賴性離子通道(VDAC)也稱線粒體穿孔蛋白，在線粒體外膜中表達(dá)水平較高，VDAC3是VDAC的3種異構(gòu)體之一。線粒體可感受細(xì)胞能量代謝水平的變化，進(jìn)而影響核基因的表達(dá)[3]。有研究證實(shí)，離子通道尤其是VDAC參與了腫瘤細(xì)胞的演化，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期方面具有重要作用[4]。因此，VDAC是近年來外源化學(xué)物所致細(xì)胞凋亡機(jī)制研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。VDAC基因表達(dá)水平增高或降低均影響線粒體功能，與細(xì)胞生存及凋亡密切相關(guān)[5]。腫瘤細(xì)胞膜上也分布著不同類型的離子通道，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其中VDAC基因的表達(dá)與腫瘤的形成有關(guān)，但與白血病細(xì)胞多藥耐藥性的相關(guān)性研究未見報(bào)道。本研究證實(shí)VDAC3基因可能在白血病細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性方面具有一定的作用，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

核糖體蛋白S4-X基因亦為耐藥與非耐藥白血病細(xì)胞差異基因之一。核糖體參與基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，具有調(diào)控機(jī)體發(fā)育等功能，與正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性密切相關(guān)。本研究也篩選出具有差異表達(dá)的3個(gè)支原體基因，分別是支原體基因JER、M64、PG18。支原體基因的高表達(dá)可能引起腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，提示支原體基因的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生有潛在的相關(guān)性。

此外，10個(gè)甘油三磷酸脫氫酶基因、1個(gè)凝血因子Ⅷ基因、7個(gè)HBE1基因、1個(gè)HSBP1基因和62個(gè)未知基因也是差異表達(dá)基因，可能在白血病細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性方面具有一定的作用。HSBP1可結(jié)合熱休克蛋白70(HSP70)基因啟動(dòng)子，減弱或阻止HSP70基因的轉(zhuǎn)錄。HSBP1是線粒體的“分子伴侶”之一，但與白血病細(xì)胞多藥耐藥性的相關(guān)性研究未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，HSBP1基因與VDAC3基因都可能參與了白血病多藥耐藥的形成，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。筆者推測(cè)，HSBP1基因的差異表達(dá)可能是調(diào)控VDAC基因參與腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵因素。VDAC3基因啟動(dòng)子區(qū)可能含有熱休克元件(HSE)，HSBP1通過與HSE的結(jié)合調(diào)控VDAC基因的表達(dá)([6-7])。

綜上所述，本研究采用SSH技術(shù)成功構(gòu)建了K562/DOX細(xì)胞與K562細(xì)胞的差異表達(dá)基因，且多數(shù)差異表達(dá)基因?yàn)榫€粒體相關(guān)基因，提示線粒體基因的表達(dá)在白血病細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性方面具有關(guān)鍵作用。本研究也篩選出一些罕見報(bào)道的基因，如HSBP1基因。這些具有調(diào)控作用的基因在白血病細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性中的作用更應(yīng)值得注意，其與線粒體相關(guān)基因的關(guān)系值得深入研究和分析。

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Multidrug resistance associated genes of leukemia separated by suppression subtractive hybridization

WangNan1，PanZhe2△，YuanHong1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory；2.DepartmentofPathology，theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity，Dalian，Liaoning116023，China)

Abstract:ObjectiveTo isolate and identify differential expression genes associated with multidrug resistance of leukemia.MethodsDifferential expression genes between leukemia cell line K562 and resistant cell lines K562/DOX were isolated by using suppression subtractive hybridization(SSH) technique.Total RNA were extracted.cDNA were synthesized and digested by restriction enzyme RsaⅠ,then connected with adopter1 and adopter2R,and linked with pMD19-T vector.Constructed vectors were transferred into E.coli.Subtracted cDNA library was constructed，and the positive clones were screened according to base sequences and homologous sequences.The differential expression genes were indentified by comparison analysis of Gene Bank database.ResultsA total of 220 differential expression genes were sequenced,including hemoglobin，ribosomes and mitochondria related genes,and heat shock factor binding protein 1 (HSPB1) gene and other genes.ConclusionSSH method and molecular cloning technique could be used to construct subtracted cDNA library of differential expression genes between drug resistant and not-resistant leukemia cells,which might be useful for further screening and cloning of differential expression genes of multidrug resistant tumor cells.

Key words:leukemia；multidrug resistance；suppressive subtractive hybridization；differential expression genes

(收稿日期：2015-11-13)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.010

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)06-0743-04

作者簡(jiǎn)介：王楠，女，主管技師，主要從事惡性血液病的實(shí)驗(yàn)室研究。(△)通訊作者，E-mail：494701814@qq.com。