付佑輝，張　舒，王海濤，蔡　峰，范艷紅，胡忠義

(1.上海市第七人民醫(yī)院呼吸內科，上海 200137；2.同濟大學附屬上海市

肺科醫(yī)院，上海市結核病[肺]重點實驗室，上海 200433)

?

·論著·

顯微鏡觀察藥物敏感性技術快速檢測痰標本中結核分枝桿菌的研究*1

付佑輝1，張舒1，王海濤1，蔡峰1，范艷紅1，胡忠義2

(1.上海市第七人民醫(yī)院呼吸內科，上海 200137；2.同濟大學附屬上海市

肺科醫(yī)院，上海市結核病[肺]重點實驗室，上海 200433)

摘要:目的探討顯微鏡觀察藥物敏感性技術(MODS)在痰液標本中結核分枝桿菌(MTB)的檢測效果，以評價其臨床應用價值。方法收集150份患者臨床痰標本，應用MODS技術、羅氏培養(yǎng)法進行MTB的檢測，將兩法的結果進行對比分析。結果MODS技術與羅氏培養(yǎng)法結果符合率為77.8%，MODS技術檢測痰標本中MTB的敏感性為93.3%，特異性為70.0%，陽性預測值(PPV)為60.8%，陰性預測值(NPV)為95.4%，正確性為77.8% 。結論MODS技術檢測痰標本中MTB具有快速、靈敏、簡便等優(yōu)點，可作為結核病細菌學快速檢測的新方法之一。

關鍵詞:痰液；結核分枝桿菌；顯微鏡觀察藥物敏感性技術

結核病仍然是嚴重威脅人類健康的重大傳染病之一[1]。目前結核病實驗室檢測技術仍不能滿足臨床需要，因此開展結核病實驗室診斷新技術對結核病診治具有重要意義。近年來Caviedes等建立了一種結核病快速診斷新技術——顯微鏡觀察藥物敏感度檢測技術(MODS)，據(jù)報道它具有簡便、快速、靈敏、價廉的優(yōu)點[2-4]。筆者在MODS技術快速檢測結核分枝桿菌(MTB)臨床分離株方法學的基礎上，進一步將其應用于患者痰液標本的結核分枝桿菌(MTB)的直接檢測，并與傳統(tǒng)的痰涂片抗酸染色法、羅氏培養(yǎng)法的結果進行分析比較，對結果不符的標本，采用Gene-Probe方法進行鑒定，以評價其檢測效果及價值。

1材料與方法

1.1材料90例臨床診斷肺結核患者痰液標本取自上海市第七人民醫(yī)院呼吸內科住院患者及結核科門診患者。60例非肺結核的肺部疾病患者痰液標本取自本院呼吸科住院患者，包括肺炎、肺癌、慢性支氣管炎、支氣管擴張等疾病的患者。MTB標準菌株(H37Rv)購自國家菌種保藏中心。

1.2儀器與試劑XDS-1B倒置顯微鏡(重慶光電儀器有限公司 )，瑞士24孔TPP細胞培養(yǎng)板。硝基苯甲酸(Sigma公司)儲存液的制備：取硝基苯甲酸純藥粉溶于0.1 mol/L 氫氧化鈉(NaOH)中，再取0.1 mol/L 氯化氫(HCl)溶液調pH值至6.5，加無菌蒸餾水制成5 mg/mL儲存液，然后將上述配制好的儲存液用無菌濾膜過濾、分裝，-20 ℃保存。應用時取出，常溫下溶解，倍比稀釋，配置成濃度為1 600 μg/mL的工作液。液體培養(yǎng)基Middlebrook 7H9培養(yǎng)基干粉(美國Difico公司)和營養(yǎng)添加劑OADC(Becton Dickinson公司)。應用液為含10%營養(yǎng)添加劑的Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基。羅氏培養(yǎng)基，鑒定培養(yǎng)基按《結核病診斷細菌學檢查規(guī)程》(規(guī)程)制備[5]。

1.3方法

1.3.1MODS技術檢測痰液標本中MTB將150份患者痰液標本液化去污染處理引后的沉淀，用液體培養(yǎng)基洗滌2遍，用6 mL液體培養(yǎng)基重懸。運用MODS技術進行檢測并同步將其接種至羅氏培養(yǎng)基進行培養(yǎng)和鑒定,每塊24孔細胞培養(yǎng)板做11份痰液標本，自孵育后第3 天開始用倒置顯微鏡進行觀察(×10目鏡與×40物鏡)，每天觀察1次，第15天后每周觀察2次，至40 d結束，具體操作方法見文獻[9]，每批標本檢測以MTB標準菌株H37Rv為質控株。

1.3.2羅氏培養(yǎng)和鑒定法藥物濃度分別為對硝基苯甲酸0.5 μg/mL、噻吩-2-羧酸肼5 μg/mL，參照文獻[5]方法操作。

1.3.3痰涂片抗酸染色法參照文獻[5]方法操作。

1.3.4Gene-Probe檢測Gene-Probe診斷試劑和檢測儀為美國Gene-Probe公司產品，購自生物梅里埃公司。按照儀器使用說明和試劑盒要求進行操作[6-7]。

1.4統(tǒng)計學處理計算其靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和符合率。對患者痰液標本中MTB應用MODS技術檢測的結果與羅氏培養(yǎng)法測定的結果進行比較分析，采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1MODS技術與羅氏培養(yǎng)法所需時間比較應用MODS技術對150份患者痰液標本中MTB進行檢測，陽性檢出時間自5～28 d不等，檢測時間中位數(shù)為11 d，而羅氏培養(yǎng)法檢測時間中位數(shù)為20 d，MODS技術檢測時間中位數(shù)短于羅氏培養(yǎng)法。

2.2痰液標本三種檢測方法檢測結果比較90份臨床確診為肺結核患者的痰液標本涂片抗酸染色法、羅氏培養(yǎng)法及MODS檢測的陽性結果分別為24份(26.7%)、30份(33.3%)和46份(51.1%)；60份非結核的肺部疾病患者痰液標本3種方法檢測的假陽性結果分別為2份(3.3%)、2份(3.3%)和1份(1.7%)；比較3種檢測方法的陽性率，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=12.42,P<0.05)。比較3種方法的假陽性率，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.54，P>0.5)，見表1、2。90份臨床確診為肺結核患者痰液標本的檢測結果表明，MODS技術與傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法結果符合率為77.8%，如以羅氏培養(yǎng)、鑒定法為判斷標準，則MODS技術檢測MTB的敏感性為93.3%(28/30)、特異性為70%(42/60)、陽性預測值(PPV)為60.8%(28/46)、陰性預測值(NPV)為95.5%(42/44)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1　　MODS技術和羅氏培養(yǎng)法結果比較(n)

表2　　MODS技術和涂片抗酸染色法結果比較(n)

2.3Gene-Probe檢測結果在60例臨床診斷為非肺結核患者痰液標本中，有1份痰涂片抗酸染色和羅氏培養(yǎng)均為陰性而MODS技術檢測為陽性，臨床分離菌株經Gene-Probe鑒定為堪薩斯分枝桿菌。在臨床診斷為肺結核的90例患者痰液標本中，有2份羅氏培養(yǎng)法陽性而MODS技術檢測結果為陰性，其臨床分離菌株Gene-Probe經鑒定，1株為MTB,1株為鳥分枝桿菌，羅氏培養(yǎng)法與MODS技術檢測結果不符有20例,痰涂片抗酸染色法與MODS技術檢測結果不符有24份。羅氏培養(yǎng)法為陰性而MODS技術檢測為陽性的痰液標本有18份，Gene-Probe檢測結果為陽性的痰液標本有16份(88.9%)，痰涂片抗酸染色法檢測結果為陰性而MODS技術檢測結果為陽性的痰液標本有24份，Gene-Probe檢測結果為陽性的痰液標本有22份(95.7%)。18份痰涂片抗酸染色法和羅氏培養(yǎng)法結果均為陰性而MODS技術檢測結果為陽性的痰液標本中，Gene-Probe檢測結果為陽性的痰液標本有17份(96%)；另外有1份臨床診斷為非肺結核患者痰液標本，痰涂片抗酸染色法和羅氏培養(yǎng)法結果均為陰性而MODS技術檢測結果為陽性，經Gene-Probe檢測結果為陽性。

3討論

目前MTB細菌學檢測技術由于存在一定缺陷，如價格昂貴、敏感性差、需時較長等，因此遠不能滿足臨床診治的需求。2000年Caviedes等建立了一種新的結核病細菌學檢測技術——顯微鏡觀察藥物敏感度檢測技術，其原理為： MTB在液體培養(yǎng)基中生長時會呈現(xiàn)特征性的索狀結構，應用倒置顯微鏡對其特征性索狀結構進行觀測，可用來判斷是否有MTB生長，據(jù)研究表明該技術具有快速、簡便、價廉等特點。隨后，有學者將其用于結核病的快速診斷，顯示出良好的應用前景[6-8]。

筆者在前期建立了MODS技術快速檢測MTB臨床分離株檢測方法學的基礎上，進一步將其應用于痰液標本中MTB的直接檢測，并與痰涂片抗酸染色法、羅氏培養(yǎng)法結果進行對比分析后，可以得出MODS技術的陽性檢出率顯著高于涂片和羅氏培養(yǎng)，如以羅氏培養(yǎng)、鑒定法為判斷標準，MODS技術具有較高的靈敏度。本研究中痰液標本的陽性檢出率、檢測時間中位數(shù)、特異度與相關文獻報道的數(shù)據(jù)相比偏低，可能與選用的痰液標本多數(shù)來自治療患者有關，其服藥后痰菌中有大量死菌存在，細菌活力較低[2,3,8-10]。在應用MODS技術直接檢測痰液標本時，因檢測所需時間比檢測臨床分離株所需的時間長，檢測過程中應采取適當措施，如本研究中用膠帶密封24孔細胞培養(yǎng)板，并放置密封的塑料袋內等以防止檢測板孔中水分蒸發(fā)。

本研究對MODS技術檢測的結果與羅氏培養(yǎng)法檢查結果不符的痰液標本采用Gene-Probe檢測分析，如以Gene-Probe結果作為判定依據(jù)，合計Gene-Probe檢測47份MODS技術與涂片抗酸染色法或羅氏培養(yǎng)法檢測結果不符的痰液標本，結果40份(85.1%)的MODS技術檢測結果與Gene-Probe結果相同，說明MODS技術檢測結果具有較高的準確性。筆者早期研究發(fā)現(xiàn)臨床常見的2種非MTB——恥垢分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌也具有索狀生長特征[11-13]，因此，筆者在MODS技術檢測MTB中進行了優(yōu)化改良，在應用MODS技術檢測時加入對硝基苯甲酸作為菌種鑒定試劑，使MODS技術對MTB的檢測更加特異。本研究有1份非結核患者痰液標本涂片和培養(yǎng)均為陰性而MODS技術為陽性，菌株經Gene-Probe鑒定為堪薩斯分枝桿菌，進一步得到了證實。

綜上所述，將MODS技術用于痰液標本中MTB的檢測，具有快速、準確的優(yōu)點，同時該技術在檢測過程中無需昂貴儀器設備，只需孵箱以及顯微鏡就能進行檢測，因此操作簡便、檢測成本低廉[11-13]，可以滿足臨床對MTB快速檢測的需求，由于MODS技術檢測的是活菌，因此可為肺結核活動性診斷提供較有力證據(jù)，其價廉的優(yōu)勢也易被大多數(shù)基層結核病檢測機構所接受，具有良好應用前景。但是值得注意的是MODS技術檢測是活菌，操作中一定要注意生物安全，操作過程中以下幾方面需注意：(1)進行實驗操作時，采取相應的防護措施(如需穿戴好口罩、帽子、隔離服、手套等)；(2)實驗操作需在生物安全柜中進行；(3)應用倒置顯微鏡觀察結果時，24孔細胞培養(yǎng)板需密封后才能進行觀察，觀察時需小心謹慎，避免打翻；(4)實驗結束后，24孔細胞培養(yǎng)板及廢棄物必須經高溫高壓滅菌后，方可按一般垃圾處理。

參考文獻

[1]全國結核病流行病學抽樣調查技術指導組.第四次全國結核病流行病學抽樣調查報告[J].中華結核和呼吸雜志，2002，25(1)：3-7.

[2]Caviedes L,Lee TS,Gilman RH,et al.Rapid,efficient detection and drug susceptibi-lity testing of Mycobacterium tuberculosis in sputum by microscopic observation of broth cultures.The Tuberculosis Working Group in Peru[J].J Clin Microbiol,2000,38(2):1203-1208.

[3]Moore DA,Evans CA,Gilman RH,et al.Microscopic-observation drug susceptibi-lity assay for the diagnosis of TB[J].N Engl J Med,2006,35(5):1539-1550.

[4]金文國，胡忠義.顯微鏡觀察藥物敏感性檢測技術及其在結核病診斷和耐藥性檢測中的應用[J].中華預防醫(yī)學雜志，2008，42(3)：134-136.

[5]中國防癆協(xié)會基礎專業(yè)委員會.結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程[M].北京：中國教育文化出版社，2006:13-37.

[6]Kirschner P，Springer B,Vogel U，et al.Genotypic identification of mycobact-eria by nucleic acid sequence determination：report of a 2-year experience in a clinical laboratory[J]．J Clin Microbiol,1993,31(1)：2882-2889．

[7]Clarridge JE．Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases[J]．Clin Microbiol Rev,2004,17(3)：840-862．

[8]Shiferaw G,Woldeamanuel Y,Gebeyehu M,et al.Evaluation of microscopic ob-servation drug susceptibility assay for detection of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis[J].J Clin Microbiol,2007,45(2):1093-1097.

[9]Moore DA,Mendoza D,Gilman RH,et al.Microscopic observation drug suscepti-bility assay,a rapid,reliable diagnostic test for multidrug-resistant tuberculosis suitable for use in resource-poor settings[J].J Clin Microbiol,2004,42(10):4432-4437.

[10]Caws M,Ha DT,Torok E,et al.Evaluation of the MODS culture technique for the diagnosis of tuberculous meningitis[J].PLoS ONE，2007,11(1):1173.

[11]付佑輝，鄭瑞娟，王潔，等．顯微鏡觀察藥物敏感性技術快速檢測結核分枝桿菌研究[J]．中華醫(yī)院感染學雜志,2009,23(2)：3178-3181．

[12]付佑輝，鄭瑞娟，王沽，等．顯微鏡觀察藥物敏感度檢測技術在二線抗結核藥耐藥性檢測應用[J]．中華檢驗醫(yī)學雜志，2010,33(2)：25-29．

[13]陸俊梅，王潔，黃曉辰，等.顯微鏡觀察藥物敏感性檢測技術在痰標本直接藥敏試驗中的應用[J].中華預防醫(yī)學雜志，2011,45(1)：21-25.

Evaluation microscopic observation drug susceptibility assay in detecting mycobacterium tuberculosis in sputum*1

FuYouhui1，ZhangShu1,WangHaitao1,CaiFeng1,FanYanhong1，HuZhongyi2

(1.DepartmentofRespiratoryMedicine,theSeventhPeople′sHospitalofShanghai,Shanghai200137,China;2.TBKeyLaboratoryofShanghai,ShanghaiPulmonaryDiseaseHospitalAffiliatedtoTongjiUniversity,Shanghai200433,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effect of microscopic observation drug susceptibility assay(MODS)for testing Mycobacterium tuberculosis in sputum,and to evaluate its clinical value.MethodsA total of 150 sputum samples were collected from patients with pulmonary tuberculosis,and Mycobacterium tuberculosis were detected by Lowenstein-Jensen (L-J) method and MODS,and compared the results of the two methods.ResultsThe concordance rates of the test results of sputum sample between MODS and L-J was 77.8%.The sensitivity and specificity of MODS were 93.3% and 70.0%,positive predictive value (PPV) was 60.8%,negative predictive value (NPV) was 95.4%，as well as accuracy by MODS was 77.8%.ConclusionMODS assay could be used as a rapid tuberculosis detection method,with rapid,sensitive,simple,and other advantages.

Key words:sputum;Mycobacterium tuberculosis;microscopic observation drug susceptibility assay

(收稿日期：2015-12-11)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.004

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)06-0728-03

基金項目：上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生和計劃生育委員會衛(wèi)生科技項目(PW2012B-4)。

作者簡介：付佑輝，男，主治醫(yī)師，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病診斷研究。