張俏忻，肖穎秀，程碧珍

(汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院:1.檢驗科；2.神經(jīng)內(nèi)科，廣東汕頭 515041)

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·論著·

白細胞異常增加對精液質(zhì)量及氧化應激的影響*1

張俏忻1，肖穎秀2，程碧珍1

(汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院:1.檢驗科；2.神經(jīng)內(nèi)科，廣東汕頭 515041)

摘要:目的研究白細胞(WBC)異常增加對精液質(zhì)量及氧化應激的影響。方法共收集52份WBC異常增高精液標本和50份WBC正常精液標本，彩色精子自動分析系統(tǒng)分析精液常規(guī)，以魯米諾為探針，運用化學發(fā)光法檢測精子活性氧(ROS)水平。分別采用硫代巴比妥酸法和黃嘌呤氧化酶法檢測精液中丙二醛(MDA)和總超氧化物歧化酶(T-SOD)的水平。結(jié)果WBC異常組和WBC正常組的精液常規(guī)參數(shù)中總活力、前向運動力和正常精子比率與WBC正常組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.008；P=0.005；P=0.003)；精子運動參數(shù)中曲線速度(VCL)(P=0.023)、直線速度(VSL)(P=0.010)、平均路徑速度(VAP)(P=0.011)、擺動性(WOB)差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；精子形態(tài)異常率差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.008)。WBC異常組較WBC正常組精液標本中ROS、MDA顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而T-SOD在兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論WBC異常增高可引起精子質(zhì)量下降，其機制可能與WBC增加釋放過多的活性氧有關(guān)。

關(guān)鍵詞:白細胞；精子；活性氧

白細胞(WBC)在精液中的作用一直存在爭議，有文獻報道WBC的存在有利于精子質(zhì)量的提高，可以清除死亡或損傷的精子，留下健康的精子，從而提升男性的生殖能力，增加受孕機會[1-2]。但是某些文獻觀察到WBC對精子參數(shù)呈負面影響，尤其是精子的活力和穿透力，生殖系統(tǒng)感染所引起的WBC精子癥被認為是授精能力下降的早期原因[3-4]。WBC是精液中活性氧(ROS)的重要來源，而后者的異常增加可造成精子細胞損傷，本試驗旨在研究WBC對精液質(zhì)量及氧化應激的影響。

1資料與方法

1.1一般資料52例受試個體均來自2013年7～12月汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院的生殖中心，共收集52份WBC異常增高(WBC>1×106/mL)的精液標本(白細胞異常組)，標本來自平均年齡(31.3±4.4)歲的男性，50份WBC正常(WBC<1×106/mL)精液標本(WBC正常組)，來自平均年齡(35.4±5.5)歲的男性。兩組年齡差異無統(tǒng)計學意義(t=0.988，P=0.219)。

1.2標本采集標本收集及采集時間為禁欲2～7 d后，用手淫法取精液，精液標本使用45%和90%的梯度離心法分離精子，吸取45%和90%中間部分的精子為標本。

1.3精液常規(guī)分析使用北京偉力9100精子質(zhì)量分析系統(tǒng)，將液化后精液混勻，吸出5 μL標本，加到精液計數(shù)板中，按世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定的標準分析精子各項參數(shù)。精液參數(shù)包括精液體積、pH值、精子水平、總活力、前向運動力、正常形態(tài)精子比率；運動參數(shù)包括直線速度(VSL)、曲線速度(VCL)、平均路徑速度(VAP)、前向性(STR)、精子側(cè)擺幅度(ALH)、運動直線性(LIN)、擺動性(WOB)、平均移動角度(MAD)、鞭打頻率(BCF)；精子形態(tài)包括異常形態(tài)精子、頭部異常、頸部/中斷異常及尾部異常。精液WBC檢測采用聯(lián)苯胺染色方法，WBC>1×106/mL被定義為WBC精子癥。

1.4精子活性氧ROS檢測ROS產(chǎn)物使用魯米諾(luminol;Sigma Aldrich)作為探針進行檢測。精子細胞經(jīng)PBS清洗后，調(diào)整終濃度為20×106/mL收集，少精患者(少于20×106/mL) luminol信號按照精子比例放大到20×106/mL。將溶解在DMSO中的luminol (10 μL,5 mmol/L)加入到400 μL的精子懸液中，立刻記錄數(shù)據(jù)。將5 μL luminol加入到400 μL的PBS溶液中作為空白對照。25 μL H2O2和 10 μL luminol 混合懸液作為陽性對照。熒光信號使用熒光分光光度儀測量15 min。結(jié)果用相對熒光單位Relative luciferase activity(RLU)/20×106sperm/15 min表示。

1.5精液微量丙二醛(MDA)測定精子膜脂類過氧化反應的程度以反應產(chǎn)物MDA的產(chǎn)量表示，MDA測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法。取待測精液0.1 mL為測定管，并設(shè)測定空白管、標準管及標準空白管，按照說明書操作，分別加入相應試劑。

1.6總超氧化物歧化酶(T-SOD)檢測使用黃嘌呤氧化酶法，按照說明書操作，每毫升反應液中超氧化物歧化酶(SOD)抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD活力單位(U)。

2結(jié)果

2.1WBC增加對精子參數(shù)的影響WBC異常組總活力、前向運動力和正常精子比率與WBC正常組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1　　精液WBC與精子參數(shù)的關(guān)系±s)

2.2WBC增加對精子運動參數(shù)的影響WBC異常組與WBC正常組相比精子運動參數(shù)VCL、VSL、VAP、WOB具有統(tǒng)計學差異 (P<0.05)，見表2。

表2　　精液WBC與精子運動參數(shù)的關(guān)系±s)

2.3精液WBC與精子形態(tài)異常的關(guān)系WBC異常組與WBC正常組的精子形態(tài)異常率差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中頭部異常增高明顯，見表3。

2.4精液WBC對精液中活性氧水平及氧化損傷的影響WBC異常組較WBC正常組精液標本中ROS、MDA顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而兩組T-SOD差異無發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

表3　　精液WBC與精子形態(tài)的關(guān)系

表4　　精液WBC對精液中活性氧水平及氧化損傷的影響

Log(ROS+1)：ROS相對熒光強度的Log轉(zhuǎn)換形式。

3討論

有文獻報道WBC在精子參數(shù)、精子功能和男性不育中具有不良作用，與正常生育組相比，不育男性WBC數(shù)量明顯增加。研究表明，精液WBC增多可導致精液量減少，精子密度、活力、受精能力降低，還可導致精子細胞染色質(zhì)改變、精子DNA損傷、未成熟生精細胞和畸形精子數(shù)目增加等[5-6]。但是，也有學者認為精液WBC增高與男性不育并無關(guān)聯(lián)。Tomlinson等[7]研究顯示精液WBC增多或WBC亞群分布變化并不影響精子質(zhì)量。Kiessling等[8]發(fā)現(xiàn)WBC精子癥者的正常形態(tài)精子增加。本次試驗結(jié)果顯示，WBC異常組總活力、前向運動力和正常精子比率較WBC正常組都有所降低，兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時發(fā)現(xiàn)精液中增高的WBC對精子運動參數(shù)有影響，WBC異常組與WBC正常組相比，精子運動參數(shù)VCL、VSL、VAP、WOB差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。有研究表明精子運動能力下降與WBC增高有關(guān)，后者可使精子膜上多聚不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，造成精子膜硬度增加，膜流動性減弱，精子運動能力下降甚至喪失。此外，有研究認為隨著WBC水平增加，精子畸形率也增加。筆者比較了WBC異常組和WBC正常組的精子形態(tài)，結(jié)果顯示W(wǎng)BC異常組與WBC正常組的精子形態(tài)異常率差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中頭部異常增高明顯，本次研究結(jié)果與相關(guān)文獻報道一致[9]。

盡管WBC對精液影響的機制尚未完全明確，但已有大量學者致力于此方面的研究，精液WBC中大約有95%是嗜中性粒細胞和巨噬細胞，可通過精子與WBC直接接觸或粒細胞產(chǎn)生可溶性物質(zhì)，釋放大量ROS，引發(fā)氧化應激，誘導精子細胞損傷和功能喪失。本研究對WBC異常增加的精液標本ROS及MDA、T-SOD進行了比較研究，結(jié)果顯示W(wǎng)BC異常組較WBC正常組精液標本中ROS、MDA顯著增加，具有統(tǒng)計學差異，而T-SOD在兩組之間未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學差異。ROS增加的可能機制是：位于精子中段的線粒體鞘是精子運動的供能中心，富含腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，當精液中的WBC增多時，大量釋放的ROS可使精子線粒體內(nèi)外膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，ATP合成減少，最終影響精液質(zhì)量，導致精子頂體反應和卵細胞融合能力下降，DNA片段增加。活性氧產(chǎn)生和降解的不平衡被認為是精液中氧化應激的一個重要原因，后者可造成精子膜的氧化損傷，導致相關(guān)功能的損害，例如精子活動力。有報道顯示哺乳動物精子膜的脂質(zhì)過氧化可導致膜結(jié)構(gòu)的損傷和融合，引起精子活動力的喪失。活性氧通過攻擊多不飽和脂肪酸(PUFA)來誘導脂質(zhì)過氧化(LPO)，進而引起膜流動性下降，造成精子結(jié)構(gòu)和功能的損害。除了膜功能外，LPO派生的醛類例如MDA可以通過氧化DNA堿基或與其共價結(jié)合導致DNA鏈的斷裂或交聯(lián)而引起DNA和蛋白質(zhì)的損傷。Hsieh等([10])報道MDA水平與少弱精子患者的精子水平和活動力呈負相關(guān)，認為增加的MDA水平代表了LPO對精子膜的致病效能，對精子的活動力和生存力有抑制作用。SOD在精漿和精子內(nèi)都存在，培養(yǎng)過程中加入SOD可以保護精子免受活性氧的攻擊。精子計數(shù)和總、前向運動力與精液SOD水平有顯著相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)SOD水平越高精子的數(shù)量越多，提示了SOD水平的下降與精液質(zhì)量的異常有關(guān)([11])。但本研究并未發(fā)現(xiàn)T-SOD在WBC異常增高組中有顯著降低。

綜上所述，精液中WBC異常增高可引起精子的質(zhì)量下降，其機制可能與WBC增加釋放過多的活性氧有關(guān)。

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The impacts of leukocytes elevation on the sperm quality and oxidative stress*1

ZhangQiaoxin1,XiaoYingxiu2,ChengBizhen1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofShantouUniversityMedicalCollege,Shantou,Guangdong515041,China)

Abstract:ObjectiveTo study the impacts of leukocytes elevation on the sperm quality and oxidative stress.MethodsA total of 52 elevated leukocytes specimen and 50 normal leukocytes specimen were collected.Standard semen analysis was performed.Reactive oxygen species (ROS) production was measured using luminol as the probe by the Chemiluminescence method.Malonaldehyde(MDA) content in semen was measured by the sulfo-barbitone acid method.Total superoxide dismutase(T-SOD) in semen was measured by the xanthine oxidase method.ResultsThe semen parameters including total motility(P=0.008),progressive motility (P=0.005) and normal forms (P=0.003),the sperm motion parameters including mean curvilinear velocity(VCL)(P=0.023),mean straight-line velocity(VSL)(P=0.010),mean average path (VAP)(P=0.011),swing(WOB)(P<0.001)in the elevated leukocytes group all decreased significantly compared with the normal leukocytes group.The ratio of sperm abnormality in the abnormal leukocytes group increased significantly(P=0.008).ROS levels (using the log-transformation) and Malondialdehyde (MDA) were significantly higher in the elevated leukocytes group,but no significant difference was observed for T-SOD between the two groups(P>0.05).ConclusionThe leukocytes elevation could result in the decrease of spermatozoa quality,which might be related with ROS increase.

Key words:leukocytes；sperm；reactive oxygen species

(收稿日期：2015-12-04)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.003

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)06-0726-03

基金項目：廣東省醫(yī)學科研基金資助項目(A2014441)。

作者簡介：張俏忻，男，副主任檢驗技師，主要從事分子診斷研究。