楊東海

054000　河北省邢臺(tái)市，邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院胃腸外科

?

·論著·

5-氟尿嘧啶激活TGF-β1/Smad通路治療結(jié)腸癌的機(jī)制研究

楊東海

054000河北省邢臺(tái)市，邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院胃腸外科

【摘要】目的探討5-氟尿嘧啶(5-Fu)通過(guò)激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1/Smad(TGF-β1/ Smad)通路治療結(jié)腸癌的機(jī)制。方法將24只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，氧化偶氮甲烷處理組(AOM組)和AOM及5-Fu處理組(AOM+5-Fu組)，每組8只。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR、免疫印跡及免疫組織化學(xué)方法觀測(cè)5-Fu處理后結(jié)腸癌組織中TGF-β1及其Ⅱ型受體(TGF-β RⅡ)和下游Smad基因家族成員Smad4表達(dá)的變化。結(jié)果與對(duì)照組大鼠相比，AOM組大鼠TGF-β1 mRNA、TGF-β RⅡ mRNA和Smad4 mRNA的表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與AOM組大鼠相比，AOM+5-Fu組TGF-β1 mRNA、TGF-β RII mRNA和Smad4 mRNA的表達(dá)顯著增加(P<0.01)，但沒(méi)有恢復(fù)到對(duì)照組水平。與對(duì)照組大鼠相比，AOM組大鼠TGF-β1、TGF-β RⅡ和Smad4與β-actin的比值顯著降低(P<0.01)；與AOM組大鼠相比，AOM+5-Fu組處理后TGF-β1、TGF-β RⅡ和Smad4與β-actin的比值顯著增加(P<0.01)，但沒(méi)有恢復(fù)到對(duì)照組水平。與對(duì)照組大鼠相比，AOM組大鼠TGF-β1、TGF-β RⅡ和Smad4的AOD值顯著降低(P<0.01)；與AOM組大鼠相比，AOM+5-Fu組處理后TGF-β1、TGF-β RⅡ和Smad4的AOD值顯著增加(P<0.01)，但沒(méi)有恢復(fù)到對(duì)照組水平。結(jié)論5-Fu能夠提高結(jié)腸癌組織中TGF-β1，TGF-β RⅡ和Smad4的表達(dá)，激活了TGF-β1/Smad通路。

【關(guān)鍵詞】結(jié)腸腫瘤；5-氟尿嘧啶；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；受體,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βⅡ型；Smad4蛋白

結(jié)腸癌(colon cancer)是消化系統(tǒng)主要的惡性腫瘤之一。近年來(lái)，隨著生活水平提高、飲食結(jié)構(gòu)改變以及人口老齡化等，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一[1]。關(guān)于結(jié)腸癌的治療，手術(shù)切除是最有效的治療方法，但是晚期結(jié)腸癌，化學(xué)療法和放射療法仍然是一種重要的治療手段[2]。在臨床上，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)是目前應(yīng)用最廣的抗嘧啶類化療藥物，對(duì)消化系統(tǒng)癌癥有良好療效，在腫瘤內(nèi)科治療中占有重要地位[3]。5-Fu的治療機(jī)制是通過(guò)抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成。關(guān)于5-Fu抑制腫瘤細(xì)胞DNA的合成的途徑，成為了近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。本研究通過(guò)氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)建立大鼠結(jié)腸癌模型[4]，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR、免疫印跡及免疫組織化學(xué)方法觀測(cè)5-Fu處理后結(jié)腸癌組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)及其Ⅱ型受體(TGF-β RⅡ)和下游Smad基因家族成員Smad4表達(dá)的變化，探討5-Fu通過(guò)激活TGF-β1/ Smad通路治療結(jié)腸癌的作用機(jī)制，期望所獲結(jié)果為臨床應(yīng)用5-Fu治療結(jié)腸癌提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康成年雄性Wistar大鼠24只，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重200～250 g。大鼠被分為正常對(duì)照組(Con組)，氧化偶氮甲烷處理組(AOM組)和氧化偶氮甲烷及5-Fu處理組(AOM+5-Fu組)。每組8只。

1.2結(jié)腸癌模型制備及藥物處理氧化偶氮甲烷(Sigma公司，A5486-100MG)溶解于0.9%氯化鈉溶液中，AOM組和AOM+5-Fu組大鼠接收皮下AOM注射，用于誘導(dǎo)結(jié)腸腫瘤發(fā)生，劑量為15 mg/kg體重，每周1次，連續(xù)3周。AOM+5-Fu組大鼠在最后一次AOM注射后1 d腹腔注射5-Fu(Sigma公司，F(xiàn)6627-1G)，劑量為25 mg/kg體重，每隔5天注射1次，連續(xù)注射3次。AOM組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液。正常對(duì)照組大鼠無(wú)任何處理。最后1次5-Fu注射3 d后，所有大鼠處死取結(jié)腸癌組織用于實(shí)時(shí)定量PCR、免疫印跡和免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)對(duì)照組大鼠切取部分結(jié)腸組織，AOM組和AOM+5-Fu組大鼠切取部分結(jié)腸癌組織，以0.9%氯化鈉溶液(DEPC水配制)沖洗，Trizol Reagent提取RNA，檢測(cè)其濃度及純度，按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)制備反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄，設(shè)計(jì)檢測(cè)指標(biāo)的相應(yīng)引物及內(nèi)參引物，設(shè)定反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

TGF-β1引物：5'-GACTCCTGCTGCTTTCTCC-3′

5'-GCGGTCCACCATTAGCAC-3′

TGF-β RⅡ引物：5'- GGACGACACCCAGCGTTTA-3' 5'- AGATCGCTCCCATAGTTCACC-3'

Smad4引物：5'- AAGGCCTAGCACCACCTTAG-3'

5'-AGCCTTAAACTCTGACCTGT-3'

GAPDH引物：5'-TGAACGGGAAGCTCACTG-3'

5'-GCTTCACCACCTTCTTGATG-3'

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，應(yīng)用7300 Systerm SDS Software 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計(jì)分析。

1.4免疫印跡檢測(cè)對(duì)照組大鼠切取部分結(jié)腸組織，AOM組和AOM+5-Fu組大鼠切取部分結(jié)腸癌組織，入4℃裂解液勻漿15 min，4℃離心，取上清，Bradford法測(cè)定蛋白濃度，用于TGF-β1、TGF-β RⅡ和Smad4免疫印跡檢測(cè)。每個(gè)樣品取50 μg總蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，入5%脫脂奶粉稀釋的山羊抗TGF-β1多克隆抗體(Santa-Cruz公司，C-16，sc-31609, 1∶500)、兔抗TGF-β RⅡ多克隆抗體(Santa-Cruz公司，L-21，sc-400, 1∶200)或山羊抗Smad4多克隆抗體(Santa-Cruz公司，C-20，sc-1909, 1∶1 000)相應(yīng)一抗4℃ 過(guò)夜。PVDF膜以TTBS洗3次，10 min/次。洗膜后加相應(yīng)的熒光2抗IgG(1∶3 000)，室溫孵育2 h。TTBS洗膜(3次，10 min/次)。ECL增強(qiáng)免疫發(fā)光后顯色，采集圖片。用Gel-ProAnalyzer軟件測(cè)量免疫印跡條帶相對(duì)吸光度值，計(jì)算與內(nèi)參(β-actin)免疫印跡條帶相對(duì)吸光度的比值，進(jìn)行分析。

1.5免疫組織化學(xué)檢測(cè)對(duì)照組大鼠切取部分結(jié)腸組織，AOM組和AOM+5-Fu組大鼠切取部分結(jié)腸癌組織，4%多聚甲醛固定24 h，入30%蔗糖液過(guò)夜(4℃)，冰凍切片(40 μm)。然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)SABC法染色。主要步驟為：抗原修復(fù)；正常血清室溫孵育切片 30 min；TGF-β1(1∶100)、TGF-β RⅡ(1∶50)和Smad4(1∶200)一抗4℃ 孵育48 h；1∶500生物素化二抗室溫孵育2 h；1∶500鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物室溫孵育1 h；DAB顯色5 min；蘇木精復(fù)染；常規(guī)梯度脫水、透明、封片。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)以PBS 替代一抗。Olympus顯微鏡采集圖片；IPP6.0圖像分析軟件測(cè)量免疫反應(yīng)強(qiáng)度平均光密度(AOD)值，進(jìn)行分析。

2結(jié)果

2.13組大鼠實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果與對(duì)照組大鼠相比，AOM組大鼠TGF-β1 mRNA、TGF-β RⅡ mRNA和Smad4 mRNA的表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與AOM組大鼠相比，5-Fu處理后TGF-β1 mRNA、TGF-β RⅡ mRNA和Smad4 mRNA的表達(dá)顯著增加(P<0.01)，但沒(méi)有恢復(fù)到對(duì)照組水平。見(jiàn)圖1，表1。

圖13組大鼠TGF-β1 mRNA(A)、TGF-β RⅡ mRNA(B)和Smad4 mRNA(C)表達(dá)結(jié)果

表13組大鼠TGF-β1 mRNA、TGF-β RⅡ mRNA和

Smad4 mRNA表達(dá)結(jié)果

組別TGF-β1mRNATGF-βRⅡmRNASmad4mRNACon組85.5±5.990.1±6.574.8±6.5AOM組43.3±4.9*44.9±6.7*40.6±6.5*AOM+5-Fu組73.4±6.3*#77.6±7.8*#62.4±9.2*#

注：與Con組比較，*P<0.01；與AOM組比較，#P<0.01

2.23組大鼠免疫印跡結(jié)果與對(duì)照組大鼠相比，AOM組大鼠TGF-β1、TGF-β RⅡ和Smad4與β-actin的比值顯著降低(P<0.01)；與AOM組大鼠相比，5-Fu處理后TGF-β1、TGF-β RⅡ和Smad4與β-actin的比值顯著增加(P<0.01)，但沒(méi)有恢復(fù)到對(duì)照組水平。見(jiàn)圖2，表2。

2.33組大鼠免疫組織化學(xué)結(jié)果與對(duì)照組大鼠相比，AOM組大鼠TGF-β1、TGF-β RⅡ和Smad4的AOD值顯著降低(P<0.01)；與AOM組大鼠相比，5-Fu處理后TGF-β1、TGF-β RⅡ和Smad4的AOD值顯著增加(P<0.01)，但沒(méi)有恢復(fù)到對(duì)照組水平。見(jiàn)圖3，表3。

圖23組大鼠TGF-β1、TGF-β RⅡ和Smad4免疫印跡條帶(A)及與β-actin的比值;B:TGF-β1;C:TGF-β RⅡ;D:Smad4

表23組大鼠TGF-β1、TGF-β RⅡ和Smad4蛋白表達(dá)結(jié)果

組別TGF-β1TGF-βRⅡSmad4Con組2.65±0.282.77±0.225.80±0.22AOM組1.15±0.15*1.36±0.15*1.77±0.19*AOM+5-Fu組1.93±0.14*#2.39±0.21*#4.51±0.32*#

注：與Con組比較，*P<0.01；與AOM組比較，#P<0.01

圖33組大鼠TGF-β1(A)、TGF-β RⅡ(B)和Smad4(C)免疫組織化學(xué)AOD值結(jié)果

表33組大鼠TGF-β1、TGF-β RⅡ和Smad4

免疫組織化學(xué)AOD值結(jié)果

組別TGF-β1TGF-βRⅡSmad4Con組0.62±0.080.67±0.060.54±0.06AOM組0.22±0.04*0.20±0.05*0.20±0.03*AOM+5-Fu組0.50±0.05*#0.54±0.08*#0.41±0.05*#

注：與Con組比較，*P<0.01；與AOM組比較，#P<0.01

3討論

本研究通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR、免疫印跡及免疫組織化學(xué)方法顯示，AOM處理組大鼠結(jié)腸癌組織中TGF-β1, TGF-β RII和Smad4在基因和蛋白水平的表達(dá)比正常結(jié)腸組織顯著降低，與AOM處理組大鼠相比，5-Fu處理后大鼠結(jié)腸癌組織中TGF-β1，TGF-β RⅡ和Smad4的表達(dá)顯著提高，上述結(jié)果提示5-Fu可以通過(guò)激活TGF-β1/Smad通路對(duì)大鼠結(jié)腸癌具有一定的治療作用。

臨床上，結(jié)腸癌的表現(xiàn)缺乏特異性，給臨床早期明確診斷增加了困難，確診往往需要結(jié)腸鏡檢查[2]。近年來(lái)，我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響著患者的生存質(zhì)量。因此，對(duì)結(jié)腸癌的治療具有非常重要的臨床意義。研究顯示，結(jié)腸癌的腫瘤發(fā)生與多種分子通路有關(guān)，如TGF-β1/Smad通路、Wnt/β-catenin通路、誘生型一氧化氮合酶(iNOS)分子、熱休克蛋白-90(HSP-90)分子以及環(huán)氧合酶-2(COX-2)分子途徑等[5]。因此，對(duì)上述分子途徑的干擾，能夠?qū)Y(jié)腸癌的治療具有一定的臨床意義。有研究報(bào)道，結(jié)腸癌及胃癌患者中存在TGF-β RⅡ的失活及Smad基因的突變，導(dǎo)致TGF-β1/Smad通路的中斷[6]，20%～25%的結(jié)腸癌患者中存在TGF-β RⅡ基因的突變[7]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，AOM處理組大鼠TGF-β1，TGF-β RⅡ和Smad4的表達(dá)顯著降低，這與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。而激活TGF-β1/Smad通路，用于惡性腫瘤治療方面的研究相對(duì)較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，5-Fu能夠明顯提高AOM引起的結(jié)腸癌組織中TGF-β1，TGF-β RⅡ和Smad4的表達(dá)，顯示5-Fu激活了TGF-β1/Smad通路。其激活機(jī)制可能為：結(jié)腸癌組織中升高的TGF-β1與TGF-β RⅡ結(jié)合后，激活并募集轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βⅠ型受體(TGF-β RⅠ)，形成二聚體受體復(fù)合物。隨后，TGF-β RⅡ磷酸化TGF-β RⅠ的甘氨酸-絲氨酸富集區(qū)域，然后活化TGF-β RⅠ的絲氨酸/蘇氨酸活性?；罨腡GF-β RⅠ磷酸化受體調(diào)節(jié)的Smads蛋白Smad 2和Smad 3，使Smad 2和Smad 3得構(gòu)象發(fā)生改變，從受體復(fù)合物中釋放出來(lái)，進(jìn)而被Smad 4蛋白的MH2結(jié)構(gòu)域識(shí)別并形成異質(zhì)二聚體復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)，與序列特異的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合，激活特定的靶基因，通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯，促進(jìn)分化和凋亡，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[8,9]。Smad4作為T(mén)GF-β1介導(dǎo)的信號(hào)通路中的一種關(guān)鍵因子，其表達(dá)的升高能夠抑制細(xì)胞過(guò)度增殖與生長(zhǎng)[10]。研究表明，Smad4基因是一種腫瘤抑制基因[11]，Smad4基因的突變，導(dǎo)致Smad4的活性降低，引起TGF-β1信號(hào)通路的中斷，最終誘發(fā)癌癥的發(fā)生[12,13]。本研究從結(jié)腸癌標(biāo)本上觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)觀察到5-Fu能夠提高結(jié)腸癌組織中TGF-β1，TGF-β Ⅱ和Smad4的表達(dá)，激活了TGF-β1/Smad通路。上述研究結(jié)果為臨床應(yīng)用5-Fu治療結(jié)腸癌提供一定的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

1Fleshman JW, Smallwood N.Current concepts in rectal cancer.Clin Colon Rectal Surg,2015,28: 5-11.

2Kim JH.Chemotherapy for colorectal cancer in the elderly.World J Gastroenterol,2015,21: 5158-5166.

3Chang PK,Chiang MH,Jao SW,et al.The outcome of 5-fluorouracil chemotherapy after the completion of neoadjuvant chemoradiotherapy,administered until 2 weeks before rectal cancer resection.J Chin Med Assoc,2015,78: 475-480.

4Watanabe H,Kashimoto N,Ushijima M,et al.Effects of a water-soluble extract of Ganoderma lucidum mycelia on aberrant crypt foci induced by azoxymethane and small-intestinal injury by 5-Fu in F344 rats.Med Mol Morphol,2013,46: 97-103.

5Chen J,Huang XF.The signal pathways in azoxymethane-induced colon cancer and preventive implications.Cancer Biol Ther,2009,8:1313-1317.

6Markowitz S,Wang J,Myeroff L,et al.Inactivation of the type II TGF-beta receptor in colon cancer cells with microsatellite instability.Science,1995,268: 1336-1338.

7Derynck R,Akhurst RJ,Balmain A.TGF-beta signaling in tumor suppression and cancer progression.Nat Genet,2001,29: 117-129.

8Krafft E1,Lybaert P,Roels E,et al.Transforming growth factor Beta 1 activation, storage, and signaling pathways in idiopathic pulmonary fibrosis in dogs.J Vet Intern Med,2014,28: 1666-1675.

9Strand DW,Liang YY,Yang F,et al.TGF-β induction of FGF-2 expression in stromal cells requires integrated smad3 and MAPK pathways.Am J Clin Exp Urol,2014,2: 239-248.

10Flanders KC,Heger CD,Conway C,et al.Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections.J Histochem Cytochem,2014,62:846-863.

11Howe JR,Roth S,Ringold JC,et al.Mutations in the SMAD4/DPC4 gene in juvenile polyposis.Science,1998,280:1086-1088.

12Hata A,Shi Y,Massagué J.TGF-beta signaling and cancer: structural and functional consequences of mutations in Smads. Mol Med Today,1998,4: 257-262.

13Salovaara R,Roth S,Loukola A,et al.Frequent loss of SMAD4/DPC4 protein in colorectal cancers.Gut,2002,51: 56-59.

The action mechanism of 5-fluorouracil in treatment of colon cancer by activating TGF-β1/Smad pathway

YANGDonghai.

TheSecondHospitalAffiliatedtoXingtaiMedicalCollege,Hebei,Xingtai054000,China

【Abstract】ObjectiveTo explore the action mechanism of 5-fluorouracil (5-Fu) in treatment of colon cancer by activating TGF-β1/Smad pathway.MethodsA total of 24 male Wistar rats were randomly divided into control group,azoxymethane treatment group (AOM group),AOM plus 5-Fu treatment group (AOM+5-Fu group),with 8 rats in each group. The expression levels of transforming growth factor-β1 (TGF-β1),TGF-β typeⅡ receptor (TGF-β RⅡ) and Smad4 of Smad gene family members were detected by Real-time quantitative PCR, Western Blot and immunohistochemistry,respectively.ResultsAs compared with those in control group, the expression levels of TGF-β1 mRNA,TGF-β RⅡ mRNA and Smad4 mRNA were significantly decreased (P<0.01). As compared with those in AOM group, the expression levels of TGF-β1, TGF-β RⅡ and Smad4 were significantly increased (P<0.01) after 5-Fu treatment.ConclusionThe 5-Fu can increase the expression levels of TGF-β1, TGF-β RⅡ and Smad4 in colon cancer tissues to activate TGF-β1/Smad pathway.

【Key words】colon cancer;5-fluorouracil;transforming growth factor-β1;receptor,transforming growth factor-β typeⅡ;Smad4 protein

(收稿日期：2015-09-08)

【中圖分類號(hào)】R 735.35

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1002-7386(2016)06-0805-04

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.06.001