楊解解，陳 鑫，李 濤，劉俊林

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州 730030)

一株枸杞內(nèi)生真菌16-3產(chǎn)橘黃色素的提取工藝及穩(wěn)定性研究

楊解解，陳 鑫，李 濤，劉俊林*

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州 730030)

藥用植物內(nèi)生菌有產(chǎn)生活性物質(zhì)的潛力，是天然功能色素的潛在來源之一.文章從溫度、pH、 光照、金屬離子、氧化劑方面探究枸杞內(nèi)生菌16-3所產(chǎn)橘黃色素的穩(wěn)定性.結(jié)果表明，該菌所產(chǎn)橘黃色素在高低溫、酸堿環(huán)境、氧化劑與紫外線條件下較為穩(wěn)定，該色素在 pH2～11環(huán)境條件下色素穩(wěn)定性高，且有增色效應(yīng).金屬離子Ca2+、Na+、Cu2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Al3+、Ba2+對(duì)該色素有護(hù)色或增色作用，無明顯不良影響.在氧化劑K2CrO7、NaClO 、FeCl3、濃H2SO4、濃HCl、濃HNO3、K2MnO4、H2O2對(duì)該色素具有護(hù)色或增色作用，無明顯不良影響.

內(nèi)生真菌;枸杞;橘黃色色素;穩(wěn)定性

天然色素因其安全無毒, 并且具有特有的營養(yǎng)價(jià)值和生理活性, 深受人們喜愛[1].微生物色素作為一種從微生物中提取的天然色素不受資源、時(shí)間和空間的限制, 具有植物色素和動(dòng)物色素不可比擬的優(yōu)越性[2].本研究分離得到的一株枸杞內(nèi)生真菌在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生色澤鮮艷的橘黃色素.枸杞在治療或調(diào)理免疫功能疾病和抗氧化、抗衰老、抗菌、抗癌、降血糖等方面有重要藥用功能.其內(nèi)生真菌在長期與之共同進(jìn)化后，可能產(chǎn)生具有與藥材枸杞活性物質(zhì)功能相同或相似的物質(zhì)[3]，所以用藥用植物枸杞內(nèi)生真菌產(chǎn)生的天然色素可能具有一定的藥理功效.

天然色素一般穩(wěn)定性較差，對(duì)光、熱、金屬離子、pH 等因素非常敏感，色價(jià)會(huì)隨著環(huán)境條件的變化而發(fā)生改變[4],色素的穩(wěn)定性決定了其應(yīng)用范圍，可見色素穩(wěn)定性的研究具有非常重要的意義.本文以一株產(chǎn)橘黃色素枸杞內(nèi)生菌 16-3為材料，對(duì)產(chǎn)生橘黃色素的穩(wěn)定性進(jìn)行初步探究，為該色素進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

枸杞內(nèi)生真菌16-3，由西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院細(xì)胞與胚胎工程實(shí)驗(yàn)室、生化與生物制藥實(shí)驗(yàn)室共同分離、保藏的中藥材枸杞內(nèi)生真菌菌株.

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA 固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL、pH5.8.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色素的提取

用接種環(huán)將分離純化后的枸杞16-3內(nèi)生真菌接種在PDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)至培養(yǎng)基中色素含量飽和后，將菌絲與培養(yǎng)基分離.棄菌絲僅留含色素的培養(yǎng)基，將含色素的培養(yǎng)基破碎并浸泡在色素溶解劑中，料液比為：質(zhì)量/體積=1/50，2 000 r/min振蕩過夜后離心[1]，吸取上層色素清液，將色素溶液于25 ℃恒溫干燥得干品色素，在4 ℃條件下保藏.

1.2.2 色素測試液配制

將干品色素溶于蒸餾水中，精確制成濃度為0.001 g/mL的色素測試液.

1.2.3 色素吸收光譜曲線的測定

取上述已經(jīng)處理過的橘黃色素，以蒸餾水作為對(duì)照組，利用紫外分光光度計(jì)在波長為 300～850 nm 間進(jìn)行吸光度測定，以10 nm為間隔進(jìn)行掃描，并記錄數(shù)據(jù)，分析得到λmax

1.2.4 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性影響

取濃度為0.001 g/mL色素溶液，分別于4 ℃、 20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃恒溫水浴條件下、黑暗環(huán)境中保溫 1 h[5].將其迅速冷卻至常溫觀察顏色變化，以蒸餾水為對(duì)照分別測定其在最大吸收波長處的吸光值，分析其在4～100 ℃溫度范圍內(nèi)的穩(wěn)定性.

1.2.5 pH對(duì)色素穩(wěn)定性影響

取濃度為0.001 g/mL色素溶液，色素溶液與酸堿試劑以3︰1的比例，對(duì)照組色素溶液與蒸餾水以3︰1的比例，分別與pH 2、pH 3、pH 4、pH 5、pH 6、pH7、pH 8、pH 9、pH 10、pH 11的酸堿試劑充分混勻，靜置1 h后于紫外分光光度計(jì)下分別測定其在最大吸收波長處的吸光值，分析比較其在各金屬離子溶液中的穩(wěn)定性.

1.2.6 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性影響

取3 mL濃度為0.001 g/mL色素溶液，分別加入含有1 mL濃度為0.2 mg/mL含有Ca2+、Na+、Cu2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Al3+、Ba2+ +的金屬離子水溶液(僅含一種金屬離子),室溫下在黑暗環(huán)境中靜置1 h，觀察溶液顏色變化，并于紫外分光光度計(jì)下測定其最大吸光值.分析比較其在各金屬離子溶液中的穩(wěn)定性.

1.2.7 氧化劑對(duì)色素的穩(wěn)定性影響

取3 mL濃度為0.001 g/mL色素溶液，分別加入1 mL濃度為0.2 mg/mL的氧化劑K2CrO7、NaClO、FeCl3、濃H2SO4、濃HCl、濃HNO3、K2MnO4、H2O2中，室溫下在黑暗環(huán)境中靜置一小時(shí)，觀察溶液顏色變化，并于紫外分光光度計(jì)下測定其最大吸光值，分析比較其在各氧化劑溶液中的穩(wěn)定性.

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)橘黃色素內(nèi)生真菌菌株及色素提取液

圖1 產(chǎn)橘黃色素枸杞內(nèi)生真菌16-3 圖2 枸杞內(nèi)生真菌16-3橘黃色素提取液

2.2 色素特征吸收光譜曲線

圖3為橘黃色素在300～850 nm 范圍內(nèi)用紫外分光光度計(jì)測試形成的圖譜.該色素在可見光范圍內(nèi)有2個(gè)吸收峰，最大吸收峰為330 nm,其對(duì)應(yīng)的最大吸光度值為1.244.

圖3 色素特征吸收光譜曲線

2.3 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性影響結(jié)果

如圖4所示,該橘黃色素在4～100 ℃溫度范圍內(nèi)能穩(wěn)定存在.其在該溫度范圍內(nèi)處理后，觀察顏色無明顯變化.再將其置于紫外分光光度計(jì)下測定其吸光值與原溶液對(duì)比，相差不大.

圖4 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性影響曲線圖

2.4 pH對(duì)色素穩(wěn)定性影響

如圖5所示,該橘黃色素在pH2～11范圍內(nèi)能穩(wěn)定存在.其在該pH范圍內(nèi)處理后，觀察顏色無明顯變化，再將其置于紫外分光光度計(jì)下測定其吸光值與原溶液作對(duì)比，相差不大.特別是在pH2～5與pH8～11時(shí)，色素出現(xiàn)明顯增色效應(yīng)，且無沉淀產(chǎn)生.說明該橘黃色素在一定酸堿環(huán)境下能穩(wěn)定存在，便于應(yīng)用，且該色素在酸性環(huán)境下的增色效應(yīng)比堿性環(huán)境下明顯.

圖5 pH對(duì)色素穩(wěn)定性影響曲線圖

2.5 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性影響結(jié)果

如圖6所示，該橘黃色素在金屬離子Ca2+、Na+、Cu2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Al3+、Ba2+環(huán)境條件下，能穩(wěn)定存在.將該色素用濃度為0.2 mg/mL的這些金屬離子處理后，觀察顏色無明顯變化.再將其置于紫外分光光度計(jì)下測定其吸光值與原溶液作對(duì)比，相差不大.其中Ba2+對(duì)該色素有明顯增色作用.

圖6 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性影響

2.6 氧化劑對(duì)色素的穩(wěn)定性影響結(jié)果

如圖7所示，該橘黃色素在氧化劑K2CrO7、NaClO、FeCl3、濃H2SO4、濃HCl、濃HNO3、K2MnO4、H2O2環(huán)境下能穩(wěn)定存在.將該色素用濃度為0.2 mg/mL的這些氧化劑處理后，觀察顏色無明顯變化.再將其置于紫外分光光度計(jì)下測定其吸光值與原溶液作對(duì)比，相差不大.其中K2CrO7、濃H2SO4對(duì)該色素有明顯的增色作用.

圖7 氧化劑對(duì)色素的穩(wěn)定性影響

3 結(jié)論與展望

該色素為水溶性，便于提取分離.將枸杞內(nèi)生真菌16-3于28 ℃下恒溫培養(yǎng)3 d即可初步產(chǎn)生色素，培養(yǎng)至12 d色素即在顏色、產(chǎn)量、性能各方面達(dá)到最佳狀態(tài).這時(shí)就可以開始提取進(jìn)行生產(chǎn)應(yīng)用.實(shí)驗(yàn)表明，該橘黃色素在4～100 ℃溫度范圍內(nèi)能穩(wěn)定存在，在生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)溫度的限制小，在一定范圍內(nèi)不必?fù)?dān)心因溫度問題而造成色素品質(zhì)下降.在pH2～11范圍內(nèi)能穩(wěn)定存在,且在pH2～5與pH8～11時(shí)，色素出現(xiàn)明顯增色效應(yīng).在生產(chǎn)實(shí)踐中可適量加入硫酸化氫氧化鈉以提高色素品質(zhì)，使顏色更鮮艷.此種色素用于酸性飲料的生產(chǎn)，不僅可以增加色澤度，還可能存在一些枸杞中有效物質(zhì)使飲料的潛在效用增加，但本實(shí)驗(yàn)未對(duì)該色素的安全性進(jìn)行過詳細(xì)嚴(yán)格的研究，如要用于食品生產(chǎn)中，需進(jìn)一步檢驗(yàn)其安全性[6].金屬離子Ba2+、氧化劑 K2CrO7、濃H2SO4對(duì)該色素都有明顯增色作用，在非食品應(yīng)用的實(shí)際生產(chǎn)中可適量加入其中之一[7]，提高產(chǎn)品色澤.

本文所提取的橘黃色色素是中國傳統(tǒng)藥用植物枸杞的次生代謝物，其與枸杞長期共生可能產(chǎn)生與之具有相同或相似功能的藥理活性物質(zhì)，可用于抗氧化、抗衰老、抗菌等方面的保健品或藥品的研究.該色素在理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，食用安全上還有待于進(jìn)一步的研究，以期為藥品、化妝品、食品、保健品行業(yè)做出一定的貢獻(xiàn).

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2016-11-10

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楊解解(1997—), 女,湖南洪江人.

TS202.3

A

1009-2102(2016)04-0033-04