譚 強，繆 睿

(西北民族大學(xué) 化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730124)

大孔吸附樹脂提取粗壯女貞苦丁茶總黃酮及抗氧化活性

譚 強，繆 睿

(西北民族大學(xué) 化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730124)

目的：研究大孔吸附樹脂分離純化苦丁茶總黃酮的最佳工藝及黃酮化合物的抗氧化活性.方法：采用大孔吸附樹脂法獲得總黃酮.利用紫外分光光度法測定苦丁茶總黃酮不同濃度下在體外對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基和ABTS自由基的清除能力.結(jié)果：大孔吸附樹脂提取最佳工藝為上樣流速為3 mL/min,上樣濃度為1.2 mg/mL,其黃酮類化合物在體外抗氧化的能力包括ABTS自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基，在不同濃度下的最大清除能力分別為88.65%、87.94%、89.11%和73.21%.結(jié)論：總黃酮對4種自由基有良好的清除效果.

苦丁茶; 總黃酮; 抗氧化

貴州粗壯女貞苦丁茶，木犀科屬.其在降血脂，降血壓，提高免疫力，預(yù)防高血壓、動脈硬化等方面有很好的效果[1].黃酮類化合物廣泛存在于藥用植物中，為長期生長過程中的一次代謝產(chǎn)物[2],具有抗菌，抗病毒作用[3]，還具有抗癌作用[4].黃酮類化合物可在食物油中溶解，作為添加抗氧化劑[5].本文采用大孔吸附樹脂法提取總黃酮，進(jìn)行抗氧化活性的探索，并為粗壯女貞苦丁茶的開發(fā)提供參考.

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器

中國藥典篩，干燥箱，紫外分光光度計.

1.1.2 材料

粗壯女貞苦丁茶，1,1-二苯基-2-苦基肼DPPH2,2-聯(lián)氮基-雙-(3乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽、大孔吸附樹脂.

1.2 方法

1.2.1 大孔吸附樹脂的處理

本實驗對苦丁茶總黃酮類化合物的分離純化采用的是D101大孔吸附樹脂的方法.加入用95%的乙醇浸泡過的大孔吸附樹脂，乙醇應(yīng)高于樹脂表面約30 cm(注：因該裝填無氣泡)靜置24 h后.再用兩倍樹脂體積的95%的乙醇，以2BV/h的流速通過樹脂層，浸泡4 h.再用95%的乙醇洗至流出液與水以1∶5混合不渾濁.再用蒸餾水洗至無醇味，用配置的5%的鹽酸浸泡2 h，水洗至中性.最后用配置的2%濃度的氫氧化鈉溶液浸泡3 h，水洗至中性，備用.

1.2.2 上樣流速的確定

將預(yù)處理好的D101大孔吸附樹脂裝入洗凈的玻璃層析柱中，將樣品上柱，控制上樣流速為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL/min,分步收集每管均6 mL.當(dāng)流出液的吸光度達(dá)到上樣液的十分之一，則停止上樣，由公式Qc=(C0-Cc) V0/m計算出不同上樣液的吸附量.上樣流速對吸附量的影響如圖1所示.C0為樣品物質(zhì)的初始量；Cc為吸附液中樣品物質(zhì)剩余量；V0為吸附液體積；M為大孔吸附樹脂質(zhì)量.

圖1 上樣流速對吸附量的影響趨勢圖

由圖1可知，在流速為1.0 mL/min至3 mL/min時呈逐漸上升趨勢.在3 mL/min時達(dá)到最大值.從3 mL/min到5 mL/min呈現(xiàn)下降趨勢.可知上樣流速為3 mL/min為最佳流速.

1.2.3 上樣濃度的確定

將預(yù)處理好的D101大孔吸附樹脂裝入洗凈的玻璃層析柱中，再將苦丁茶提取物配置成不同濃度(0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0mg/L)的樣品水溶液進(jìn)行動態(tài)吸附，由公式E =(C0-Cc)C0×100%計算出樣品的吸附率.上樣濃度對吸附率的影響繪制如圖2.C0為黃酮類物質(zhì)的初始量；Cc為吸附液中黃酮類物質(zhì)剩余量.

圖2 上樣濃度對吸附率的影響趨勢圖

由圖2可知，當(dāng)濃度從0.2 mg/L至1.2 mg/L時，濃度逐漸變大.從1.2 mg/L后，隨著濃度的增加吸附率反而下降.從圖2可知，當(dāng)上樣液濃度為1.2 mg/L時吸附率最大，所以最佳上樣濃度為1.2 mg/L.

1.2.4 不同濃度的乙醇洗脫

上樣液濃度為1.2 mg/mL的苦丁茶提取液以3 mL/min的流速加入大孔吸附樹脂，先用蒸餾水洗脫5個體積柱.將水溶性雜質(zhì)除去，再分別用30%至80%的乙醇洗脫5個體積柱(每個梯度增加10%)除去酚類和總皂苷等物質(zhì).經(jīng)檢驗查證后，70%的洗脫部分為總黃酮，真空干燥后備用.將黃酮溶液配制成1 mg/mL溶液備用.

2 粗壯女貞苦丁茶抗氧化活性的測定

2.1 清除羥基自由基能力的測定

用fenton反應(yīng)生成羥基自由基，水楊酸可以與羥基自由基結(jié)合生成有色的水楊酸化合物，用紫外分光光度計(波長510 nm)測定吸光度，得出清除率，取10 mL容量瓶中加入2 mL 2 mmol/LFeSO4，1 mL 6 mmol/LH2O2，混合均勻后加入4 mL 6mmol/L水楊酸乙醇溶液，用去離子水定容.在37 ℃浴下反應(yīng)20 min,以去離子水為參比測定吸光度，即為A0.取10 mL容量瓶按照上述再加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的總黃酮溶液，得出Ax.再用蒸餾水替代1 mL 6 mmol/L的H2O2，得出Ax0.計算式：OH清除率=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100%，并與Vc做對比得出圖3.

圖3 苦丁茶總黃酮對羥基自由基清除率

由圖3可知，總黃酮溶液清除羥基自由基的能力在1.0 mg/mL下最大.

2.2 清除超氧陰離子能力的測定

取4.5 mL的Tris-Hcl緩沖溶液，加入3 mL去蒸餾水混合均勻后于25 ℃的恒溫水浴鍋中預(yù)熱20分鐘.再加入鄰苯三酚溶液0.4 mL，立即混勻，加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的總黃酮溶液，于25 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)4分鐘后迅速加入0.1 mL 8 mol/L的鹽酸終止反應(yīng).用溶劑代替鄰苯三酚作為本底對照組A0，用Tris-HCl緩沖溶液代替樣品作為空白對照組Ax0，在325 nm波長處測定吸光度Ax.結(jié)果見圖4.根據(jù)公式：超氧陰離子的清除率(%)=[1-((Ax-A0)/Ax0)]×100 %.

圖4 苦丁茶總黃酮對超氧陰離子清除率

由圖4可知，苦丁茶清除超氧陰離子的能力強于Vc,并在1.0 mg/mL處達(dá)到最大值.

2.3 清除DPPH自由基的測定

DPPH(1,1-二苯基-2-苦味阱基)是一種穩(wěn)定的有機氮自由基，在517 nm處具有最大的吸收波長，DPPH的醇溶液顯紫色.取200 μmol/L 3 mL DPPH于10 mL容量瓶中，加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的總黃酮溶液，混合均勻后暗處靜置半個小時.同時以無水乙醇代替DPPH溶液作為本底對照Ax0，以無水乙醇代替樣品作為空白對照A0.于517 nm處測定吸光度Ax，得出清除率，其計算式：DPPH清除率(%)=[1-((Ax-Ax0)/A0)]*100%.并與VC溶液做對比，得出圖5.

圖5 苦丁茶總黃酮對DPPH自由基清除率

由圖5可知，總黃酮對DPPH自由基的清除率明顯弱于Vc,但在高濃度下差別不大.

2.4 清除ABTS能力的測定

總黃酮對 ABTS 自由基清除作用.將 7.0 mmol/L ABTS 溶液與 2.0 mmol/L過硫酸鉀混合，暗處靜置12 h.將ABTS溶液用95%乙醇稀釋40倍后，取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的總黃酮溶液，分別加入4.0 mL ABTS 溶液，振蕩30 s，室溫下暗反應(yīng)6 min 后測量在波長 734 nm 的吸光度(A1).1.0 mL總黃酮溶液加入蒸餾水4.0 mL后，測定吸光度( A0) ；4.0 mL ABTS溶液與100 μL丙酮混勻后的測吸光度(A2) .清除率 = [( A2-(A1-A0)]/A2×100% .以Vc為對照，得出圖6.

圖6 苦丁茶總黃酮對ABTS自由基清除率

由圖6可知，兩者在高濃度下對ABTS自由基的清除率基本相等.

3 結(jié)論

本實驗通過大孔吸附樹脂法提取粗壯女貞苦丁茶總黃酮，并進(jìn)行抗氧化活性的實驗，并與Vc對比.實驗結(jié)果說明，粗壯女貞苦丁茶總黃酮對超氧陰離子、DPPH自由基、ABTS自由基隨用量濃度的增大而增大，羥基自由基在1.0 mg/mL出現(xiàn)最大值，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，可開發(fā)成天然抗氧化劑應(yīng)用于食品藥品中.抗氧化劑可清除自由基，調(diào)整和改善人體生理功能，達(dá)到預(yù)防和治療慢性疾病的目的[6].大孔吸附樹脂法提取粗壯女貞苦丁茶總黃酮的實驗具有操作簡便、重現(xiàn)性好、再生處理方便，并無重金屬污染，有機溶劑毒性殘留少的優(yōu)點[7]，但粗壯女貞苦丁茶的進(jìn)一步開發(fā)還有待深入研究.

[1] 鄢東海.粗壯女貞苦丁茶有益性功能[J].貴州茶葉，2006，(3)：34.

[2] 陳紅梅，謝翎.響應(yīng)面法優(yōu)化半枝蓮黃酮提取工藝及體外抗氧化分析[J].食品科學(xué)，2016，37(02)：45.

[3] 蘇志維，馬仲輝，高成海等.雙腎藤根部抑菌成分的篩選研究[J].中藥材，2016，39(05)：1057-1061.

[4] 曹冉冉，高嘉嶼，劉華清等.皂角刺中二氫黃酮醇類化合物及其細(xì)胞毒活性研究[J].中草藥，2016，47(05)：707-711.

[5] 金亞香，孫晶，李洪軍.大葉苦丁茶抗氧化成分的提取及活性的比較研究[J].食品工業(yè)科技，2015，36(04)：151.

[6] 吳奇，朱晨星，樊曉蘭等.抗氧化劑與延長壽命的相關(guān)性研究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2016，30(05)：588-589，591-592.

[7] 胡志軍，郝麗君，王南溪等.D-101大孔吸附樹脂分離純化橘皮中的黃酮類物質(zhì)[J].食品科學(xué)，2010，37(08)：69.

Extraction of Total Flavonoid from Ligustrum Lucidum Kudingcha Using Macroporous Adsorption and Its Antioxidant Activity

TAN Qiang, MIAO Rui

(Northwest University for Nationalities, Lanzhou, 730124, China)

Objective：Study on the Optimum Technology of Isolation and Purification of Total Flavonoids from Kudingcha and Antioxidant Activity of Flavonoids by Macroporous Adsorption Resin. Methods：The total flavonoid was extracted utilizing macroporous adsorption resin. The scavenging abilities of DPPH free radical, superoxide anion radical, hydroxyl radical and ABTS free radical in vitro were determined with ultraviolet spectrophotometry. Results：The optimum extraction conditions were as follows: the flow rate was 3mL/min. The loading concentration was 1.2mg/mL. The scavenging abilities of ABTS, DPPH, superoxide anion and hydroxyl radicals in vitro were 88.65%, 87.94%, 89.11% and 73.21%, respectively. The scavenging ability of the flavonoid compounds in vitro was 88.65%.Conclusion：Total flavonoid has good scavenging effects on four kinds of free radicals.

Kudingcha; Total flavonoid; Antioxidant

2016-10-20

譚強(1995—)，男，四川人,主要從事制藥工程方面的研究.

R284.2

A

1009-2102(2016)04-0011-05

[基金簡介]西北民族大學(xué)實驗室開放項目.