刁建新，代歡，李海葉，楊運(yùn)高

·實(shí)驗(yàn)性肝炎·

多功能蛋白APE1/Ref1在肝衰竭大鼠肝細(xì)胞不同部位的表達(dá)意義*

刁建新，代歡，李海葉，楊運(yùn)高

目的研究多功能蛋白酶脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶(APE1/Ref1）在慢加急性肝衰竭大鼠肝細(xì)胞不同部位的表達(dá)意義。方法將30只SD大鼠隨機(jī)分為對照組（n=15）和模型組（n=15）。采用四氯化碳（CCL4）聯(lián)合D-氨基半乳糖（D-GalN）和內(nèi)毒素（LPS）注射法制備肝衰竭模型，使用B超監(jiān)測篩選成功模型。檢測血清ALT、AST、總膽紅素(TBIL），采用HE染色觀察肝組織病理學(xué)變化，采用免疫組化和免疫印跡法檢測肝組織胞漿蛋白、胞核蛋白、總蛋白APE1/Ref1的表達(dá)。結(jié)果本組實(shí)驗(yàn)，經(jīng)B超篩選模型成功率達(dá)80%；正常對照組血清ALT、AST和TBIL水平分別為（56.5±16.0）U/L、(178.7±36.5）U/L和（3.2±0.6）μmol/L，均顯著低于模型組【（620.4±347.5）U/L、（1077.7± 666.1）U/L和（21.2±16.9）μmol /L，均P＜0.05】；免疫組化法檢測模型組肝組織APE1/Ref1表達(dá)水平為（6.8±1.3）IOD，顯著低于正常對照組的【（8.1±1.2）IOD，P＜0.05】，模型組胞漿蛋白水平為（0.91±0.08）IOD，明顯高于正常對照組的【（0.18±0.01）IOD，P＜0.01】，而核蛋白和總蛋白水平分別為（0.71±0.01）IOD和（0.92±0.03）IOD，均明顯低于正常對照組【（1.41±0.04）IOD和（1.15±0.01）IOD，P＜0.05】。結(jié)論慢加急性肝衰竭大鼠肝內(nèi)APE1/Ref1表達(dá)呈現(xiàn)由細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)向胞漿內(nèi)表達(dá)的特征，總體表達(dá)呈下降水平。

肝衰竭；脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶；DNA損傷；氧化應(yīng)激；大鼠

人類脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶/氧化還原因子-1（APE1 /Ref 1）是生物大分子蛋白，在DNA堿基切除修復(fù)（BER）、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、氧化還原和活性氧的調(diào)控等多個領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用，是DNA堿基切除修復(fù)途徑的限速酶，調(diào)控著人體抑癌基因如p53基因、核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3（stat3）和缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1a）等轉(zhuǎn)錄因子，控制著不同的生物學(xué)過程，如細(xì)胞凋亡、增殖和分化[1,2]。慢加急性（亞急性）肝衰竭是在慢性肝病基礎(chǔ)上，出現(xiàn)急性肝功能失代償，肝組織在慢性肝病損害的基礎(chǔ)上發(fā)生新的、不同程度的肝細(xì)胞壞死性病變[3]，肝細(xì)胞壞死或凋亡都是肝衰竭發(fā)生的病理學(xué)基礎(chǔ)，同時伴有DNA損傷[4]。APE1/ Ref是DNA損傷修復(fù)的關(guān)鍵酶[5]，而APE1/ Ref在慢加急性肝衰竭肝組織的表達(dá)未見報(bào)道。本研究通過四氯化碳（CCL4）聯(lián)合D-氨基半乳糖（D-GalN）和內(nèi)毒素（LPS）建立慢加急性肝衰竭動物模型，檢測肝組織總蛋白、胞漿蛋白、胞核蛋白APE1/Ref 1表達(dá)，以探討APE1/Ref1在慢加急性肝衰竭發(fā)病中的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器SPF級SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量l80～220 g，由本校動物中心提供（合格證號：4402102032）。大鼠飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境內(nèi), 室溫（22±2）℃, 濕度（60±5）%,自由飲水和攝食。檢測血生化指標(biāo)試劑盒購于中生北控生物科技股份有限公司（批號：120991，122021，120956）。蘇木素、伊紅、磷酸鹽緩沖液、抗Actin多克隆抗體、抗兔二抗、抗鼠二抗均購于北京中杉金橋生物試劑有限公司，抗兔APE1/Ref1多克隆抗體購于美國Abcam公司。核漿分離蛋白試劑盒購于廣州杰特偉試劑有限公司，總蛋白提取及定量試劑盒購于美國Sigma 公司，ECL發(fā)光液購于美國Merck Millipore公司。使用德國萊卡石蠟切片機(jī)、日本尼康Eoipse Ti-s熒光倒置顯微鏡及分析軟件、意大利愛康全自動生化儀（ECHO PLUS）、美國Thermo全波段酶標(biāo)儀、半干式轉(zhuǎn)膜儀、硝酸纖維素膜（Bio-Rad公司）、瑞典MiniVE垂直蛋白電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、美國柯達(dá)2000MM全光譜多功能活體成像系統(tǒng)，使用超聲診斷儀（PHILIPS-TISO.2），腹部凸陣探頭，頻率為3.6 MHz。

1.2 肝衰竭動物模型的建立取SD大鼠30只，隨機(jī)分為正常對照組（n=15）和慢加急性肝衰竭模型組（n=15）。適應(yīng)性飼養(yǎng)l w，給予模型組大鼠40% CCL4花生油溶液2 ml.kg-1腹腔注射，2次/w，連續(xù)10 w。按照我們以前報(bào)道的方法[6]篩選肝衰竭模型成功動物，按大鼠體質(zhì)量每1 kg給予D-GalN 400 mg和LPS 10 mg腹腔注射，復(fù)制慢加急性肝衰竭模型。觀察大鼠的活動情況。48 h后按大鼠體質(zhì)量每100 g給予0.35 ml 10%水合氯醛腹腔注射，麻醉大鼠，行腹主動脈采血，3000 r/m離心，分離血清，-80℃保存。取肝葉，分成2份，1份浸泡于10%多聚甲醛中，1份凍存于-80℃冰箱。

1.3 血生化指標(biāo)的檢測使用全自動生化儀檢測。

1.4 肝組織病理學(xué)檢查取肝組織，10%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片4 μm，60℃烤片，蘇木精-伊紅染色。每只大鼠肝組織制作1張切片，高倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野觀察。應(yīng)用Nikon Eoipse Ti-s倒置顯微鏡分析圖像。

1.5 肝組織APE1/Ref1蛋白原位表達(dá)檢測采用免疫組化SP法。組織切片脫蠟、水化、檸檬酸鈉抗原修復(fù)、3%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶15 min，5%BSA封閉非特異性抗原15 min、滴加抗APE1/Ref1（1:50），4℃孵育過夜，PBS洗滌3次/5 min，滴加二抗，37℃孵育1 h，DAB顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢。隨機(jī)選取5個高倍視野（200×），觀察、拍照，應(yīng)用ipp6圖片分析軟件分析。

1.6 肝組織胞漿蛋白、胞核蛋白、總蛋白APE1/Ref1表達(dá)檢測采用Western blotting法，用電子天平秤取50 mg肝組織, 按Sigma總蛋白說明書提取總蛋白。按碧云天核質(zhì)分離總蛋白說明書提取胞漿蛋白和胞核蛋白。采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，取蛋白50μg，在12% SDS-PAGE電泳, 濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜(Millipore公司）, 5%脫脂牛奶室溫孵育1 h，分別加入抗兔APE1/Ref1多克隆抗體（1：1000）、兔抗小鼠Actin抗體（1：1000），4℃孵育過夜, TBS-T洗3次/5 min。加入HRP標(biāo)記的抗兔二抗（1:2000）和HRP標(biāo)記的抗小鼠二抗（1:2000），室溫孵育1 h, TBS-T洗滌3次/5 min。將膜用ECL化學(xué)發(fā)光液孵育1 min后曝光，并用Kodak 2000MM圖像工作站成像, 以APE1/Ref1光密度值與Actin光密度值的比值表示APE1/Ref1的相對表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝衰竭模型制備情況經(jīng)B超檢查，見正常組肝臟包膜光滑、肝實(shí)質(zhì)回聲正常；模型組肝包膜毛糙, 肝實(shí)質(zhì)回聲粗糙, 肝內(nèi)血管走行不清晰,可見肝臟腫大（圖1）。參照方芳等[7,8]報(bào)道的方法，其中3只大鼠未達(dá)到肝衰竭標(biāo)準(zhǔn)，1只大鼠死亡，模型組成模陽性率為80%左右。

圖1 B超篩選慢加急性肝衰竭大鼠模型情況

2.2 血生化指標(biāo)的變化與正常對照組比，模型組血清ALT、AST和TBIL水平明顯升高,兩組有顯著性差異(P＜0.01，表1）。

表1 兩組血生化指標(biāo)（s）的比較

表1 兩組血生化指標(biāo)（s）的比較

與對照組比，①P＜0.05

只ALT（U/L）AST（U/L）TBIL（μmol/L）對照組15 56.5±16 178.7±36.5 3.2±0.6模型組14 620.4±347.5①1077.7±666.1①21.2±16.9①

2.3 肝組織病理學(xué)表現(xiàn)正常對照小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列有序；模型組肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，肝竇擴(kuò)張并出血，小葉內(nèi)及匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞水腫變性，塊狀壞死（圖2）。

圖2 大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE，200×）A:對照組；B:模型組

2.4 肝組織APE1/Ref1原位表達(dá)情況正常對照組肝組織APE1/Ref1主要以肝細(xì)胞核表達(dá)為主；模型組APE1/Ref1以肝細(xì)胞核和細(xì)胞漿表達(dá)，與正常對照組比，模型組APE1/Ref1表達(dá)減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05，圖3）。

2.5慢加急性肝衰竭大鼠肝組織胞漿蛋白、胞核蛋白和總蛋白APE1/Ref1表達(dá)情況經(jīng)Western blot檢測，顯示正常對照組APE1/Ref1主要以細(xì)胞核中表達(dá)為主；慢加急性肝衰竭模型動物肝組織APE1/Ref1在細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白均有表達(dá)。與正常對照組比，模型組細(xì)胞漿蛋白中APE1/Ref1明顯升高，而細(xì)胞核蛋白中APE1/Ref1明顯減少(P＜0.01，圖4）。

圖3 慢加急性肝衰竭大鼠肝組織APE1/Ref1表達(dá)情況（SP，200×）A:對照組；B: 模型組與對照組比，①P＜0.05

圖4 慢加急性肝衰竭大鼠肝組織胞漿蛋白、胞核蛋白和總蛋白中APE1/Ref1表達(dá)情況A:對照組；B: 模型組與對照組比，①P＜0.05,②P＜0.01

3 討論

慢加急性肝衰竭的病理學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞核溶解，肝索斷裂，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，出血點(diǎn)，甚至出現(xiàn)大量炎細(xì)胞浸潤及肝細(xì)胞片狀壞死[9，10]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，慢加急性肝衰竭發(fā)生的機(jī)制主要與病毒感染、氧化應(yīng)激、內(nèi)毒素血癥和細(xì)胞因子紊亂有關(guān)[11]，上述因素均可以導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，它們的作用機(jī)制是激活NK細(xì)胞，釋放Fas和TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體TRAIL和IFN-γ。當(dāng)死亡因子FasL與Fas特異結(jié)合，引起受體聚集形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC），激活caspase8和Bid蛋白，引起線粒體外膜通透性改變，細(xì)胞色素C釋放入細(xì)胞漿，激活caspese3,導(dǎo)致肝細(xì)胞大量凋亡[12,13]，最終導(dǎo)致肝衰竭。在嚴(yán)重肝病患者，由于庫普弗細(xì)胞功能嚴(yán)重受損，來自門靜脈的大量內(nèi)毒素未經(jīng)解毒而溢入體循環(huán)。內(nèi)毒素可直接或通過激活庫普弗細(xì)胞釋放的化學(xué)介質(zhì)引起肝壞死，也可以與其它物質(zhì)（如半乳糖胺、四氯化碳和乙醇等）共同作用，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死[14]，從而引起肝衰竭的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)預(yù)先使用CCl4導(dǎo)致肝損傷或肝硬化，然后使用D-GalN聯(lián)合LPS打擊。D-GalN可以進(jìn)一步導(dǎo)致肝細(xì)胞RNA合成受阻，LPS可以導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥，進(jìn)一步引起肝損傷，造成肝臟的二次損傷，發(fā)生肝衰竭。通過聯(lián)合打擊建立慢加急性肝衰竭模型符合臨床慢加急性肝衰竭的發(fā)生和發(fā)展過程，對病理發(fā)生機(jī)制的研究有重要意義。肝細(xì)胞損傷使血清酶活性升高，導(dǎo)致血清AST、ALT 、TBIL水平升高[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組各生化指標(biāo)升高，反映肝細(xì)胞受損傷。病理學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證，模型組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞核溶解，片狀壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤，達(dá)到肝衰竭的標(biāo)準(zhǔn)。我們從上述的機(jī)制可知，肝衰竭與氧化應(yīng)激和細(xì)胞因子激活有關(guān)，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞DNA斷裂，發(fā)生凋亡或壞死。

APE1/ Re-f 1是DNA堿基切除修復(fù)途徑的限速酶[16]，在DNA損傷修復(fù)中具有重要的作用。在肝臟受損后，細(xì)胞DNA損傷可通過APE1/ Re-f 1進(jìn)行修復(fù)。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組細(xì)胞核中APE1/Ref1表達(dá)明顯減少，可能是參與肝細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)，導(dǎo)致消耗過多，以至于其量減少。一些生理性的刺激也可以誘導(dǎo)APE1/Ref1蛋白水平上調(diào)[17]。本實(shí)驗(yàn)通過CCl4、D-GalN、LPS外源刺激以后，模型組細(xì)胞漿蛋白中APE1/Ref1表達(dá)上調(diào)。APE1/ Ref1在肝細(xì)胞不同部位表達(dá)的變化與氧化應(yīng)激有關(guān)[18]。各種細(xì)胞APE1/ Ref1蛋白在不同部位的表達(dá)水平都與其所處的特定細(xì)胞氧化還原狀態(tài)有關(guān)[19]，許多體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)都證實(shí)，各種氧化性物質(zhì)都可以迅速地引起APE1 /Re-f 1蛋白及其mRNA水平上調(diào)，其中ROS對它的影響效應(yīng)研究最為廣泛[20]。APE1/Ref-1在正常肝細(xì)胞總蛋白中表達(dá)豐富，細(xì)胞漿蛋白中表達(dá)少量，細(xì)胞核蛋白中高表達(dá)。而在模型組中，APE1/Ref-1在總蛋白中表達(dá)減少，細(xì)胞漿蛋白中表達(dá)增加，而細(xì)胞核蛋白中表達(dá)減少。可能的機(jī)制是APE1/Ref-1參與肝細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)，使細(xì)胞核中APE1/Ref-1蛋白消耗過度，最終導(dǎo)致總蛋白表達(dá)也減少。而在細(xì)胞質(zhì)蛋白，它的表達(dá)明顯增加，可能是該蛋白由胞核轉(zhuǎn)移至胞漿，參與ROS引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。APE1/Ref1在肝細(xì)胞不同部位的表達(dá)變化對氧化應(yīng)激和DNA損傷具有調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，研究多功能蛋白APE1/Ref1在CCl4聯(lián)合D-GalN和LPS誘導(dǎo)的慢加急性肝衰竭大鼠肝臟不同部位的表達(dá)有重要的意義。促進(jìn)細(xì)胞核中APE1/Ref1的表達(dá)，有利于DNA的損傷修復(fù)，而減少細(xì)胞漿APE1/Ref1的表達(dá)，則可以減少肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激，即APE1/Ref1在不同部位的表達(dá)有不同的意義。

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（收稿：2015-07-28）

（本文編輯：陳從新）

Expression of multifunctional protein APE1/Ref1 in different parts of liver cells in rats with a-cute-on-chronicliver failure

Diao Jianxin，Dai Huan，Li Haiye，et al.
Traditional Chinese Medicine School，Southern Medical University，Guangzhou 510115，Guangdong Province，China

Objective To investigate the expression of multifunctional protein apurinic/apyrimidinic endonuclease 1（APE1/Ref1）in different parts of liver cells in rats with acute-on-chronic liver failure（ACLF）. Methods 30 SD rats were random1y divided into normal control（n=15），and ACLF model group（n=15）.ACLF models were established by intraperitoneal injections of CCL4combined with D-GalN and LPS and the establishment of liver failure model was confirmed by ultrasonography.Serum ALT，AST，and TBIL were detected by automatic biochemistry analyzer，pathologic changes in liver were revealed by HE staining，and APE1/Ref1 expression in cytoplasmprotein，nucleoprotein and total protein were detected by immunohistochemistry(IHC）and western blot.Results Success rate of model establishment screened by B ultrasound in this series was as high as 80%；serum ALT，AST and TBIL in control group were significantly lower than those in the model group[（56.5± 16.0）U/L vs.（620.4±347.5）U/L，（178.7±36.5）vs.（1077.7±666.1）U/L，（3.2±0.6）μmol/L vs.（21.2±16.9）μmol /L，respectively，P<0.05 for all]；the expression of APE1/Ref1 in model group was significantly lower than in the control[（6.8±1.3）IOD vs.（8.1±1.2）IOD，P<0.05]；APE1/Ref1 in cytoplasmprotein in model group was significantly higher than that in control group[（0.91±0.08）IOD vs.（0.18±0.01）IOD，P<0.01]，while APE1/Ref1 in nucleoprotein and total protein in model group were lower than those in control group[（0.71±0.01）IOD vs.（1.41±0.04）IOD，and（0.92±0.03）vs.（1.15±0.01）IOD，respectively，P<0.05 for both].Conclusion APE1/Ref1 are co-expressed in hepatocellular cytoplasm and nucleus，presenting transferred expression from intranucleus to intracytoplasm with a declined expression manner.

Liver failure；Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1；DNA damage；Oxidative stress；Rats

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.02.007

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號：81173262）

510515廣州市南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院

刁建新,男,32歲, 碩士研究生。主要從事消化系統(tǒng)疾病防治研究

楊運(yùn)高，E-mail:yangyungao@263.net