鄭夏生， 賴智填，成金樂*　(.國家中醫(yī)藥管理局中藥破壁草本技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)研究室，中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東中山 528437；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 00700)

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利用psbA-trnH片段鑒定羅漢果和山藥破壁草本

鄭夏生1，2， 賴智填1，成金樂1*(1.國家中醫(yī)藥管理局中藥破壁草本技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)研究室，中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東中山 528437；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

摘要[目的]解決羅漢果和山藥破璧草本DNA提取困難，而無法用分子生物學(xué)鑒定的問題。[方法]通過比較常用DNA提取試劑盒法和改良的CTAB法，利用psbA-trnH片段鑒定羅漢果和山藥破壁草本。[結(jié)果]改良的CTAB法可從羅漢果和山藥的藥材、破壁粉末和破壁草本3種形態(tài)中成功地提取出基因組DNA，并可進(jìn)一步利用DNA條形碼的psbA-trnH片段進(jìn)行分子鑒定。[結(jié)論]該方法穩(wěn)定可行，可用于羅漢果和山藥的藥材、破壁粉末和破壁草本的DNA條形碼鑒別。

關(guān)鍵詞羅漢果；山藥；破壁草本；DNA條形碼

Identification of Ultra-fine Granular Powers of SIRAITIAE FRUCTUS and DIOSCOREAE RHIZOMA bypsbA-trnHFragment

ZHENG Xia-sheng1,2,LAI Zhi-tian1,CHENG Jin-le1*

(1.The Key Laboratory of Technology of Breaking Cell Wall and Application in Chinese Medicine Decoction Pieces,Zhongshan Zhongzhi Pharmaceutical Group,Zhongshan,Guangdong 528437; 2.Institute of Chinese Materia Medica,Chinese Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700)

Abstract[Objective] To solve the problems of difficult extraction of DNA extraction from ultra-fine granular powers of SIRAITIAE FRUCTUS and DIOSCOREAE RHIZOMA.[Method] Ultra-fine granular powers of SIRAITIAE FRUCTUS and DIOSCOREAE RHIZOMA were identified bypsbA-trnHfragment by comparing the traditional DNA extraction kit and improved CTAB method.[Result] The improved CTAB method could successfully extract the medicinal materials,ultra-fine powders and ultra-fine herbs of SIRAITIAE FRUCTUS and DIOSCOREAE RHIZOMA.psbA-trnHfragment in DNA barcode was used for molecular identification.[Conclusion] This method is stable and feasible,and can be used for the DNA barcode identification of medicinal materials,ultra-fine powders and ultra-fine herbs of SIRAITIAE FRUCTUS and DIOSCOREAE RHIZOMA.

Key wordsSIRAITIAE FRUCTUS; DIOSCOREAE RHIZOMA; Ultra-fine granular power of Chinese Herbal Medicine; DNA barcode

草晶華破壁草本由廣東省中藥破壁粉粒工程技術(shù)研究開發(fā)中心(依托中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司)開發(fā)，是利用現(xiàn)代粉碎技術(shù)將傳統(tǒng)中藥飲片深加工成D90< 45 μm(300目以上)的粉體，再通過無固體添加成型技術(shù)制成的干燥顆粒狀飲片(30～100目)[1]。與傳統(tǒng)飲片相比，經(jīng)過細(xì)胞破壁后破壁草本的有效物質(zhì)溶出率更高[2-3]。破壁后藥材的顆粒粒徑非常小，失去了絕大多數(shù)的顯微特征，增加了其物種鑒定的難度。

DNA條形碼是通過基因組中一段公認(rèn)的、相對較短的DNA序列來進(jìn)行物種鑒定的生物技術(shù)，具有快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)[4]。Chen等[5]通過對近萬份藥用植物樣本進(jìn)行DNA條形碼篩選，提出一條藥用植物基因鑒定思路，即以ITS2作為標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼，以psbA-trnH作為輔助DNA條形碼[6]。DNA條形碼不僅可以從基因水平解決中藥材與混偽品的物種識別問題，同時也可用于建立中藥材二維DNA條形碼流通監(jiān)管體系，為中藥材流通監(jiān)管提供有力的技術(shù)支持[7]。

羅漢果為葫蘆科植物羅漢果Siraitiagrosvenorii(Swingle.) C.Jeffrey ex A.M.Lu et Z.Y.Zhang的干燥成熟果實。山藥為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb.的干燥根莖。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)這2個品種的藥材和破壁草本均無法按照常規(guī)的試驗方法進(jìn)行DNA條形碼鑒別。原因可能是由于DNA提取困難，導(dǎo)致后續(xù)的PCR失敗。筆者利用psbA-trnH片段鑒定羅漢果和山藥破壁草本，克服了這2個品種的DNA提取困難，并成功進(jìn)行后續(xù)的DNA條形碼鑒別。

1材料與方法

1.1試驗材料草晶華破壁草本均由中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，詳細(xì)信息見表1。中藥飲片經(jīng)過破壁處理后得到破壁粉末，再被制備成破壁草本(圖1)。以上藥材由中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司賈世清中藥師鑒定，憑證標(biāo)本保存于國家中醫(yī)藥管理局中藥破壁飲片技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)研究室。

表1　樣品信息

1.2試驗方法

1.2.1樣品前處理。①傳統(tǒng)飲片：用滅菌的解剖刀切取約0.1 g，切碎，置于陶瓷研缽中，加入等量的PVP-40，用力研磨粉碎，稱取0.1 g用于DNA提取。②破壁粉末：直接稱取樣品50 mg用于DNA提取。③破壁草本：分別稱取各樣品50 mg，置于2.0 mL離心管中，加入2顆Φ 5 mm的滅菌鋼珠，用生物樣品均質(zhì)儀(愛施德，Bioprep-24)以6.0 m/s 振蕩30 s，重復(fù)振蕩2次，每次間隔30 s，使樣品變成粉末狀，即可用于DNA提取。

1.2.2DNA提取。①試劑盒法：按照新型快速植物基因組DNA提取試劑盒(百泰克，DP3111)說明書操作。②改良CTAB法：向各樣品管中加入800 μL CTAB free緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl)，劇烈振蕩，旋轉(zhuǎn)混勻5 min，13 000 r/min離心3 min，棄上清液；重復(fù)該步驟1～2次。向各樣品管中加入800 μL CTAB緩沖液(3% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl)，充分振蕩混勻，65 ℃金屬浴中孵育3 h，期間每隔10 min左右顛倒混勻數(shù)下。加入600 μL氯仿-異戊醇(24∶1，V∶V)，充分振蕩混勻，靜置5 min，13 000 r/min離心15 min，小心吸取上清于新的1.5 mL離心管中。加入等體積-20 ℃預(yù)冷的異丙醇，-20 ℃放置10 min，13 000 r/min離心15 min，棄上清。加入800 μL -20 ℃預(yù)冷的75%乙醇，上下顛倒混勻數(shù)次，13 000 r/min離心15 min，重復(fù)1次。棄盡上清，打開離心管蓋子室溫晾干5 min，加入50 μL 65 ℃預(yù)熱的ddH2O，小心吹打沉淀，將可溶部分轉(zhuǎn)移至新的離心管中。取適量DNA用于質(zhì)量檢測，其余的置于-20 ℃保存，備用。

1.2.3DNA質(zhì)量檢測。取5 μL DNA，加45 μL ddH2O，混合均勻。以ddH2O為空白對照，用紫外分光光度計測定OD260和OD280，通過計算OD260/OD280評價DNA質(zhì)量。

另取5 μL DNA，加1 μL 6 × DNA Loading buffer，混合均勻。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶，評價DNA完整度。

1.2.4PCR擴(kuò)增和測序。PCR反應(yīng)體系：2 × PowerTaqPCR MasterMix(百泰克，PR1701)12.5 μL，正反向引物(psbA_F：GTTATGCATGAACGTAATGCTC，trnH_R：CGCGCATGGTGGATTCACAATCC)各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃，2 min；94 ℃，30 s，52 ℃，20 s，72 ℃，50 s，35個循環(huán)；72 ℃，5 min。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測各PCR產(chǎn)物，目的區(qū)域出現(xiàn)清晰條帶的樣品則送樣測序。

圖1　試驗所用樣品Fig.1　Sample used in this research

1.3數(shù)據(jù)處理利用CodonCode Aligner(版本：5.1.5.0)分析測序所得的原始峰圖，拼接后去除低質(zhì)量區(qū)和引物區(qū)。所得各樣品的DNA序列分別在NCBI上進(jìn)行BLASTN；在中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)(http://www.tcmbarcode.cn/china/index.php optionid=174)上進(jìn)行比對，取同源性(Identity)最高的比對結(jié)果。2結(jié)果與分析

2.1DNA質(zhì)量2種方法提取得到的DNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測所得的吸光度比值見表2。由表2可知，試劑盒法提取的DNA質(zhì)量較差，OD260/OD280均與理想值1.80～2.00相差較大；而改良CTAB法獲得的DNA質(zhì)量較好，OD260/OD280與理想值1.80～2.00 相差較小。

從電泳結(jié)果看，試劑盒法未見明顯的DNA條帶；而改良的CTAB法則可以獲得清晰的DNA條帶(圖1)。綜合紫外分光光度值與電泳結(jié)果，說明改良的CTAB法更適合用于提取羅漢果和山藥的基因組DNA。

2.2序列比對結(jié)果PCR擴(kuò)增后，改良CTAB法制備的樣品可獲得清晰的DNA條帶，而試劑盒法制備的樣品均為陰性(圖3)。將陽性樣品送檢測序，發(fā)現(xiàn)6個樣品均為陽性結(jié)果。說明改良的CTAB法用于提取羅漢果和山藥的基因組DNA是可靠的。

3種形態(tài)的羅漢果樣品經(jīng)過PCR所得的psbA-trnH序列一致(均為173 bp)，與中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)和NCBI數(shù)據(jù)庫中羅漢果Siraitiagrosvenorii的序列(登錄號分別為：HAP00104和JN406966)同源性達(dá)100%(圖4A)；3種形態(tài)山藥樣品的psbA-trnH序列也是一致的(均為208 bp)，與中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)中山藥Dioscoreapolystachya的序列(登錄號：HAP00148)同源性達(dá)100%，與NCBI數(shù)據(jù)庫中山藥的序列(登錄號：JQ60354)同源性達(dá)99%(圖4B)。表明psbA-trnH可用于羅漢果和山藥中藥破壁草本的物種鑒定。

表2　2種方法提取得到的DNA吸光度

圖2　2種方法提取得到的DNA電泳結(jié)果Fig.2　Electrophoresis result of DNA extracted by two different methods

圖3　PCR結(jié)果Fig.3　PCR results

注：A.羅漢果，B.山藥?！ote：A was SIRAITIAE FRUCTUS and B was DIOSCOREAE RHIZOMA.圖4　序列比對結(jié)果Fig.4　Results of sequence alignment

3結(jié)論與討論

DNA條形碼用于中藥相關(guān)制品的物種鑒別，具有快速、高效的特點(diǎn)。該技術(shù)主要依靠對樣品DNA條形碼的成功擴(kuò)增和測序，而前提是要獲得足夠量和達(dá)到一定純度的基因組DNA。DNA提取是一門相對成熟的技術(shù)，目前已有許多DNA提取試劑盒被開發(fā)出來，用于不同類型樣品的DNA提取。然而，這些試劑盒在植物DNA提取方面效果較差。因為植物種類紛繁復(fù)雜，且含有多酚和多糖等次生代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致DNA提取困難甚至失敗。中藥材主要來源于植物，部分品種甚至經(jīng)過高溫處理等炮制，更加重了DNA提取的困難。CTAB法是常用的DNA提取方法，許多學(xué)者以該方法為基礎(chǔ)，通過改良部分試驗環(huán)節(jié)或試劑以獲得適合于自身研究的物種[8-9]。

該研究采用的改良CTAB法主要有3處改進(jìn)：①在藥材粉碎環(huán)節(jié)采用PVP-40與樣品一起研磨，一方面可以在未使用液氮的情況下增加樣品的可研磨性，另一方面PVP-40可以與樣品中的多酚、萜類物質(zhì)起絡(luò)合作用及與多糖結(jié)合[10]，在裂解過程中將這些雜質(zhì)除去。②采用CTAB free緩沖液預(yù)處理研磨后的樣品粉末[11]，除去色素等雜質(zhì)。③將CTAB的濃度由2%提高至3%[12]，同時將裂解條件改進(jìn)為65 ℃裂解3 h(試劑盒法為常溫裂解10 min)，加強(qiáng)對樣品細(xì)胞的裂解，以更大程度地獲取DNA。由此可知，該研究所用的改良CTAB法可以獲得純度較高、量較多的DNA。

中藥破壁草本是經(jīng)過細(xì)胞破壁處理的一類新型飲片，由于失去絕大多數(shù)的細(xì)胞及組織顯微特征，造成物種鑒定困難。特別是部分中藥材，由于藥材經(jīng)過炮制，或者藥材自身包含影響DNA提取的次生代謝產(chǎn)物，往往導(dǎo)致其DNA提取困難，而無法用于分子鑒定。DNA條形碼技術(shù)近年來在中藥鑒定方面的推廣，為破壁草本等粉末或顆粒狀中藥制品的物種鑒定提供了技術(shù)參考。

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中圖分類號S 188

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)06-163-04

收稿日期2016-01-22

作者簡介鄭夏生(1987- )，男，廣東揭陽人，博士，從事藥用植物分子生物學(xué)研究。*通訊作者，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥質(zhì)量研究。