閆洪雪，劉 露，李 麗，趙宏濤，張鵬鵬，梁文輝

（1.青島明月海藻集團(tuán)有限公司，海藻活性物質(zhì)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266400；2.青島明月藍(lán)海生物科技有限公司，山東青島 266400）

根瘤菌是一類(lèi)革蘭陰性菌，這類(lèi)菌廣泛的分布于土壤中并能與豆科植物共生，通過(guò)侵染豆科植物根部形成根瘤，固定空氣中的分子氮，可為植物提供充足的氮素營(yíng)養(yǎng)[1]，還可降低因施用化肥引起的環(huán)境污染。土壤中氮素70%來(lái)自生物固氮，而根瘤菌與豆科植物的共生固氮體系所固定的氮量就占到了約總量的65%[2-3]。草產(chǎn)業(yè)在國(guó)民經(jīng)濟(jì)和農(nóng)牧業(yè)發(fā)展中起基礎(chǔ)性作用[4]，紫花苜蓿是豆科植物，因具有廣泛的適應(yīng)性和優(yōu)良的生態(tài)效應(yīng)，品質(zhì)優(yōu)良且產(chǎn)量高，在我國(guó)的農(nóng)牧業(yè)中占有重要地位[5-6]。苜蓿根瘤菌這一共生固氮體系的穩(wěn)定高效是栽培苜蓿獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵因素[7]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家對(duì)苜蓿根瘤菌的研究越來(lái)越深入，從單純的固氮領(lǐng)域延伸至生理、生化、生態(tài)領(lǐng)域，同時(shí)也對(duì)固氮菌劑、菌肥的開(kāi)發(fā)利用進(jìn)行了大量探索[8-9]。本研究對(duì)豆科植物根瘤菌的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，不僅能夠降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)量，還可減少工業(yè)氮肥施用量，減輕環(huán)境污染[10]，具有重要的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)效益。

1 材料和方法

1.1 菌種

本研究所用菌種M2為本實(shí)驗(yàn)室自行篩選鑒定得到，液體菌種20%甘油-20℃保存。

1.2 常用儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱（韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司，LRH-150B）、超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，SW-CJ-2F）、電熱旋轉(zhuǎn)式恒溫?fù)u床（江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠，THZ-D）、渦旋振蕩器（澳門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.3 試劑

蔗糖、酵母粉、豆餅粉、甘露醇、氯化鈉、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCO3、NaOH、HCl、pH試紙。

1.4 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方

YMA培養(yǎng)基：甘露醇10 g/L，酵母粉0.8 g/L，氯化 鈉 0.1 g/L，KH2PO40.25 g/L，K2HPO40.25 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCO33.5 g/L。

1.5 最適溫度的選擇

設(shè)置溫度梯度 26，28，30，32，34 ℃。甘油保存的液體菌種于冰盒中融化，取500 μL菌液加入到50 mL YMA液體培養(yǎng)基（滅菌前pH值7.0）中，180 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)36 h后，鏡檢無(wú)雜菌即進(jìn)行稀釋涂布計(jì)數(shù)。

1.6 最適pH值的選擇

設(shè)置YMA培養(yǎng)基滅菌前pH值梯度6.5，7.0，7.5，8.0，8.5。甘油保存的液體菌種于冰盒中融化，取500 μL菌液加入到50 mL YMA液體培養(yǎng)基中，180 r/min，30℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)36 h后，鏡檢無(wú)雜菌即進(jìn)行稀釋涂布計(jì)數(shù)。

1.7 最佳轉(zhuǎn)速的選擇

設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速梯度 140，160，180，200，220 r/min。甘油保存的液體菌種于冰盒中融化，取500 μL菌液加入到50 mL YMA液體培養(yǎng)基（滅菌前pH值7.5）中，30℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)36 h后，鏡檢無(wú)雜菌即進(jìn)行稀釋涂布計(jì)數(shù)。

1.8 優(yōu)化培養(yǎng)基

用蔗糖代替YMA培養(yǎng)基中成本較高的甘露醇，添加豆餅粉作氮源，設(shè)置蔗糖和豆餅粉的不同用量及比例，設(shè)6組處理。分別是：（1）蔗糖10 g/L+豆餅粉2 g/L；（2）蔗糖 10 g/L+豆餅粉 4 g/L；（3）蔗糖 16 g/L+豆餅粉 2 g/L；（4）蔗糖 16 g/L+豆餅粉 4 g/L；（5）蔗糖 20 g/L+豆餅粉2 g/L；（6）蔗糖20 g/L+豆餅粉4 g/L。在最適溫度、pH值及最適轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)36 h后計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株在不同培養(yǎng)溫度條件下生長(zhǎng)情況

將在不同溫度條件下培養(yǎng)的M2菌株發(fā)酵液培養(yǎng)36 h后取樣鏡檢，稀釋涂布計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖1。

從圖1中可以看出，該菌的最適培養(yǎng)溫度為30℃，在此溫度條件下菌數(shù)最多。

2.2 菌株在不同pH值條件下生長(zhǎng)情況

將不同pH值條件培養(yǎng)的M2菌株發(fā)酵液培養(yǎng)36 h后取樣鏡檢，無(wú)雜菌稀釋涂布計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖2。

從圖2中可以看出，該菌在滅菌前培養(yǎng)基pH值7.5的條件下生長(zhǎng)狀況最佳。酸或堿性條件下的菌數(shù)均受到影響。

2.3 菌株在不同培養(yǎng)轉(zhuǎn)速條件下生長(zhǎng)情況

前面確定最適pH值和溫度后，設(shè)定不同轉(zhuǎn)速梯度進(jìn)行試驗(yàn)，培養(yǎng)36 h后取樣進(jìn)行稀釋涂布計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，設(shè)定轉(zhuǎn)速180 r/min時(shí)，菌生長(zhǎng)情況最佳。

2.4 配方優(yōu)化結(jié)果

對(duì)6組配方培養(yǎng)的發(fā)酵液進(jìn)行計(jì)數(shù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖4所示。

從圖4中可以看出，優(yōu)化后的配方均提高了發(fā)酵液菌數(shù)，其中以處理（5）（蔗糖20 g/L+豆餅粉2 g/L）的配方菌數(shù)最高，可穩(wěn)定在90×108cfu/mL。

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)對(duì)苜蓿根瘤菌M2進(jìn)行溫度、pH值、轉(zhuǎn)速的選擇及發(fā)酵配方的優(yōu)化，得出了該菌培養(yǎng)的最適溫度為30℃，培養(yǎng)基滅菌前的最佳pH值為7.5，發(fā)酵轉(zhuǎn)速最佳設(shè)定為180 r/min，在YMA培養(yǎng)基基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化后，最適的培養(yǎng)配方為：蔗糖20 g/L，豆餅粉2 g/L，酵母粉0.8 g/L，氯化鈉 0.1 g/L，KH2PO40.25 g/L，K2HPO40.25 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCO33.5 g/L。在該條件和配方下，M2的液體發(fā)酵的菌數(shù)可以穩(wěn)定在90×108cfu/mL。相對(duì)于甘露醇來(lái)說(shuō)，蔗糖和豆餅粉的成本較低，取材和來(lái)源廣泛，利用蔗糖和豆餅粉極大地提高了產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本，為大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。

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