嚴　鑫， 石　氵恬, 陳哲杰, 傅超美

(1.成都中醫(yī)藥大學 藥學院， 四川 成都　611137；

2.成都市動物疫病預防控制中心， 四川 成都　610041)

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芪藍顆粒最佳提取工藝研究

嚴鑫1， 石氵恬2, 陳哲杰1, 傅超美1

(1.成都中醫(yī)藥大學 藥學院， 四川 成都611137；

2.成都市動物疫病預防控制中心， 四川 成都610041)

摘要：為了優(yōu)選芪藍顆粒的最佳提取工藝條件.以R′S-告依春、毛蕊異黃酮苷的含量和干膏收率為指標，采用L9(34)正交設計試驗考察提取時間、加水量和提取次數(shù)對芪藍顆粒提取工藝的影響.芪藍顆粒的最佳提取工藝為，提取3次，每次8倍量水，提取2 h.結果表明，優(yōu)選出的最佳提取工藝合理、穩(wěn)定，適合工業(yè)化大生產(chǎn).

關鍵詞：芪藍顆粒；R′S-告依春；正交試驗

0引言

將中藥用于防治動物疾病及提高生產(chǎn)性能有著悠久的歷史，并已形成了一套完整的理論體系[1].芪藍顆粒由黃芪、板藍根兩味中藥組成，具有清熱解毒功效，體現(xiàn)為抗炎、調節(jié)免疫等藥理作用[2-3]，對豬繁殖與呼吸綜合征病毒具有很好的防治效果[4].為建立科學合理的提取工藝，本實驗采用正交試驗法，以處方中黃芪指標成分毛蕊異黃酮苷和板藍根指標成分R′S-告依春的含量及收膏率為指標，考察提取時間、加水量、提取次數(shù)對黃芪和板藍根水提工藝的影響，從而優(yōu)選出芪藍顆粒的最佳提取工藝條件.

1儀器與試藥

1.1儀器

實驗所用儀器包括：Agilent 1200型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；METTLER AE240型電子分析天平(十萬分之一)，梅特勒—托利多儀器有限公司；202-2型干燥箱，上海市試驗儀器總廠.

1.2試藥

實驗所用試藥包括：R,S-告依春對照品(批號，141121)、毛蕊異黃酮苷對照品(批號，150326)購于成都普菲德生物技術有限公司；板藍根飲片(批號1403003)、黃芪(批號，1401003)購自新荷花中藥飲片股份有限公司，藥材經(jīng)檢驗符合《中國藥典》2015年版有關規(guī)定.甲醇、乙腈(色譜純)，購自美國Sigma-Aldrich公司；水為超純水，其余試劑均為分析純.

2方法與結果

2.1色譜條件

采用同一色譜條件同時測定R,S-告依春和毛蕊異黃酮苷，其色譜條件為：Diamonsil色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相A為磷酸水溶液(含1%磷酸)，流動相B為乙腈，采用梯度洗脫；梯度程序為0～20 min：9% B，20～22 min：9%～20% B，22～55 min：20%～30% B；檢測波長245 nm；體積流量1 mL/min，進樣量10 μL；理論板數(shù)不低于3×103.

2.2對照品溶液的制備

2.2.1R,S-告依春對照品溶液制備.

取R,S-告依春對照品適量，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解并定容，配成濃度為1.07×10-4g/mL的R,S-告依春對照品貯備液.

2.2.2毛蕊異黃酮苷對照品溶液制備.

取毛蕊異黃酮苷對照品適量， 精密稱定， 置于10 mL容量瓶中， 加甲醇溶液溶解并定容， 配成濃度為5.16×10-4g/mL的毛蕊異黃酮苷對照品貯備液.

2.3供試品溶液的制備

稱取黃芪藥材70 g，板藍根藥材30 g，置圓底燒瓶中，按“2.4”項下正交試驗設計的不同工藝條件制備9組溶液，濃縮至300 mL.分別精密吸取5 mL，以12 000 r/min離心15 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過，制得供試品溶液.

2.4正交試驗設計

采用L9(34)正交設計表，根據(jù)預實驗結果，以提取時間、加水量和提取次數(shù)為考察因素，以R,S-告依春和毛蕊異黃酮苷的含量及干膏收率為考察指標，因素水平表見表1.

表1　L9(34)正交試驗設計因素水平表

2.5方法學考察

2.5.1線性關系考察.

分別精密吸取2、5、8、10、15 mL R,S-告依春對照品貯備液和2、4、6、8、10 mL毛蕊異黃酮苷對照品貯備液，置于25 mL容量瓶中，分別加甲醇溶液稀釋至刻度，配成不同濃度對照品溶液，進樣10 μL，在“2.1”項色譜條件下測定.分別以進樣量為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標繪制標準曲線，其回歸方程、r值及線性范圍見表2.

表2　R,S-告依春和毛蕊異黃酮苷線性關系

2.5.2精密度實驗.

分別取R,S-告依春和毛蕊異黃酮苷對照品溶液，分別重復進樣6次，進樣量10 μL，依各法測定，記錄峰面積.測得R,S-告依春和毛蕊異黃酮苷的RSD分別為1.09%和0.66%，結果表明，儀器精密度良好.

2.5.3重復性實驗.

按正交試驗設計方法制備的5號樣品溶液制備方法，平行制備5份供試品溶液，進樣量10 μL，依各法測定，記錄峰面積.測得R,S-告依春和毛蕊異黃酮苷的RSD分別為0.63%和0.94%，結果表明，各方法重復性均良好.

2.5.4穩(wěn)定性實驗.

取正交試驗設計方法制備的5號樣品溶液方法制備的供試品溶液，4 ℃下放置0、2、4、6、8、10 h，進樣量10 μL，依各法測定，記錄峰面積.測得R,S-告依春和毛蕊異黃酮苷的RSD分別為0.57%和0.63%，結果表明，樣品溶液在配置后10 h內均穩(wěn)定.

2.5.5加樣回收率實驗.

分別稱取3份黃芪70 g、板藍根30 g，分成3組，按已知量(藥材含量)分別加入1.0倍R,S-告依春和毛蕊異黃酮苷對照品溶液，按正交試驗設計的5號供試品的方法制備，依各法測定，計算R,S-告依春和毛蕊異黃酮苷的平均回收率分別為102.42%和99.47%，RSD分別為0.47%和1.924%.

2.6干膏收率測定

精密吸取按各正交試驗設計制備的水提液25 mL，分別置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥至恒重，置于干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計算干膏收率.

2.7樣品定量測定

分別按照正交試驗設計不同工藝條件制備的9組供試品溶液，進樣量10 μL，依各法測定，記錄峰面積，計算R,S-告依春和毛蕊異黃酮苷的含量及干膏收率，結果見表3、表4.

表3　L9(34)正交試驗設計及結果

表4　方差分析表

注：F0.05(2，2)=19.00，F(xiàn)0.01(2,2)=99.00,*顯著性.

2.8正交試驗結果

以R,S-告依春和毛蕊異黃酮苷及干膏收率為化學指標Ya(加權綜合分：Ya%=Y1/Y1,Max×15+Y2/Y2,Max×55+Y3/Y3,Max×30,其中Y1為每個試驗號樣品重復取樣3次測得的R,S-告依春質量濃度的平均值，Y1,Max為9個樣品中R,S-告依春質量濃度的最大值，Y2為每個試驗號樣品重復取樣3次測得的毛蕊異黃酮苷質量濃度的平均值，Y2,Max為9個樣品中毛蕊異黃酮苷質量濃度的最大值)進行L9(34)正交試驗優(yōu)選最佳工藝條件.由直觀分析可得出，各因素對試驗的影響的重要性依次為，C(提取次數(shù))>A(提取時間)>B(加水量)；從方差分析結果得出，因素A(提取時間)和C(提取次數(shù))P<0.05，具有顯著性.由正交試驗設計的極差分析結果得到的最佳制備工藝為A2B2C3，即每次提取2 h，加8倍量水，共提取3次.

2.9驗證實驗

稱取3份處方按照確定的優(yōu)選工藝條件進行驗證實驗，結果見表5，結果表明該工藝穩(wěn)定可行.

表5　驗證實驗結果

3討論

板藍根藥材在《中國藥典》2015版一部中采用高效液相色譜法測定板藍根R′S-告依春的含量[5]，選定甲醇—0.02%磷酸溶液(7∶93)為流動相，芪藍顆粒為中藥復方制劑，成分多樣，對R′S-告依春含量測定干擾大，該色譜條件下色譜峰出峰速率較慢.對此，在參考相關文獻[6-7]基礎上，本研究以乙腈—磷酸水溶液為溶劑系統(tǒng),經(jīng)過多次色譜條件優(yōu)化實驗發(fā)現(xiàn)，當以乙腈—0.1%磷酸水溶液(9∶91)為流動相時，R′S-告依春色譜峰達到基線分離，峰形對稱度高，系統(tǒng)適應性實驗符合要求，適用于芪藍顆粒的定量分析.早期研究中發(fā)現(xiàn)，無論板藍根在體內還是體外均有明顯抗流感病毒活性[8]，R,S-告依春作為板藍根抗病毒的有效成分之一[9]，故本研究選擇R,S-告依春和處方中君藥黃芪的有效成分毛蕊異黃酮苷的含量作為考察指標，通過正交試驗設計，篩選最佳提取工藝.驗證實驗結果證明，優(yōu)選出的最佳提取工藝穩(wěn)定，適合于工業(yè)化大生產(chǎn).

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Extraction Process of Chinese Veterinary Medicine Qilan Granules by Orthogonal Experiment

YANXin1,SHITian2,CHENZhejie1,FUChaomei1

(1.School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137,China;2.Animal Diseases Control & Prevention Centre of Chengdu City, Chengdu 610041, China)

Abstract:The test is going to optimize the extraction process of Qilan granules.The contents of Epigoitrin,Calycosin-7-glucoside and yield of dry extract are used as indicators.The optimal extraction time is tested by orthogonal design L9(34).Extraction frequency and water consumption both have influence on the extraction process of Qilan granules.The results show that the optimal extraction process is as follows:the material liquor ratio of 1∶8,2 h every time and 3 times.Finally,a conclusion is drawn that the optimal extraction process obtained is reliable,stable and can be applied in industrial production.

Key words:qilan granules;epigoitrin;orthogonal test

中圖分類號：R284.2；S853.7

文獻標志碼：A

作者簡介：嚴鑫(1988 — )， 男， 碩士研究生， 從事中藥藥效與毒理研究.

收稿日期：2015-12-23.

文章編號：1004-5422(2016)01-0013-03