李志海

(鄄城縣人民醫(yī)院，山東 鄄城　274600)

?

不同濃度葡萄糖對體外培養(yǎng)人成骨細胞活性的影響及意義*

李志海

(鄄城縣人民醫(yī)院，山東 鄄城274600)

摘要：目的觀察不同濃度葡萄糖對體外培養(yǎng)的人成骨細胞的影響，探討糖尿病致骨質疏松癥可能的發(fā)病機制。方法將4種不同濃度葡萄糖(5.5，10，20，40 mmol/L)的培養(yǎng)基培養(yǎng)人成骨細胞，培養(yǎng)3~12 d。觀察葡萄糖對細胞增殖、凋亡及對細胞分泌堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(BGP)能力的影響。結果在一定濃度范圍內，葡萄糖濃度越高，細胞增殖越明顯，細胞分泌ALP和BGP的能力下降，細胞凋亡率增加。結論高糖環(huán)境對人成骨細胞分泌能力有抑制作用。

關鍵詞：葡萄糖；骨質疏松癥；人成骨細胞；堿性磷酸酶；骨鈣素

糖尿病可導致全身各系統(tǒng)發(fā)生變化。作為骨代謝的最終效應細胞之一的成骨細胞也因此受到影響。研究發(fā)現(xiàn)[1-4]糖尿病可影響動物成骨細胞活性，對人成骨細胞的研究較少。2008~2009年，我們根據(jù)糖尿病血糖升高的特點，觀察不同濃度的葡萄糖對人成骨細胞的影響，探討糖尿病導致骨質疏松的機制。

1材料與方法

1.1實驗材料

人成骨細胞，取引產1 h內的7個月齡的胎兒骼骨松質骨，根據(jù)鄭永志[5]等提供方法制備人成骨細胞。DMEM低糖型培養(yǎng)基、新生牛血清、50%葡萄糖注射液、胰酶、Ⅱ型膠原酶、噻唑藍(MTT)、二甲亞砜(DMSO)、堿性磷酸酶(AKP)測定試劑盒、降鈣素(BGP)檢測試劑盒、FITC/PI凋亡檢測試劑盒、倒置相差顯微鏡、流式細胞儀。

1.2實驗分組

將制備第3代細胞按2×104/ml接種于96孔板，更換為含5.5(生理劑量，G0組)、10(G1組)、20(G2組)、40(G3組)mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基。G0組為生理對照組，G1～G3組為實驗組。各組連續(xù)培養(yǎng)3～12 d時間。每孔設3個復孔。

1.3成骨細胞增殖、凋亡率及其ALP和BGP分泌能力的測定

各組分別在培養(yǎng)第3、6、9、12 d用MTT法檢測細胞增殖情況，使用MTT檢測數(shù)值表示細胞增值率的變化。Annexin-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡，以G0組細胞為對照設定十字門。用改良Gomori鈣鉆法及ALP檢測試劑盒檢測實驗各組ALP活性。RIA法分別檢測各組細胞分泌BGP活性。均嚴格按試劑盒說明書操作。

1.4統(tǒng)計學方法

用SPSS16.0，對所得數(shù)據(jù)進行方差分析和χ2檢測。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1形態(tài)學觀察

倒置顯微鏡下[1]：懸浮的單細胞呈折光性較高的球形。貼壁后，形態(tài)由球形變?yōu)槎嘟切魏枉[片狀，均勻分布，胞突多而長，相互連接，胞質透明，顆粒少，單核較大，有2~3個核仁。可見到細胞分裂像。光鏡下[2]：細胞分布較均勻稀疏，但有細胞密集區(qū)，細胞呈三角形，有較長的細胞間胞突，通過胞突細胞相互連接，胞質呈紅色，胞核呈圓形或橢圓形，染色較深，可到細胞分裂像，在細胞密集處有深染的鈣結節(jié)。

2.2不同濃度的葡萄糖對成骨細胞增殖的影響

在不同濃度葡萄糖作用下，第3，6，9，12 d細胞的增值率如表1所示。經統(tǒng)計分析顯示，葡萄糖濃度升高能促進成骨細胞的增殖，G1組和G2組成骨細胞增值率較G0組明顯升高(P<0.01)，但過高的葡萄糖濃度，即G3組對成骨細胞增值則無促進作用，其細胞增值率與G0組之間差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.333)。

2.3各組細胞分泌ALP 、BGP的能力比較

經分析顯示(表2)，G1組細胞分泌ALP的能力最強，明顯高于其余3組(P<0.01)。其余3組細胞分泌ALP 的能力間沒有明顯差異。G0組BGP測定值最高，明顯高于其他3組(P<0.05),但其余3組的BGP濃度間沒有明顯差異(P=0.544)。

表1　不同濃度葡萄糖作用下成骨細胞的增殖 ±s)

注：與G0組相比*P<0.01,**P=0.333

表2　不同濃度葡萄糖作用下成骨細胞分泌ALP 、BGP的測量結果

注：與其他各組比較*P<0.01，▲P<0.05。

2.4細胞凋亡率

實驗組在第12d的早期凋亡率(LL)分別為5.13%，6.12%，8.01%，晚期凋亡率(UR)分別為：5.60%，10.44%，8.11%。

3討論

骨質疏松，是破骨細胞和成骨細胞之間活性不平衡的結果。糖尿病易并發(fā)骨質疏松癥已被公認，且動物實驗表明在糖尿病大鼠病程早期即表現(xiàn)為成骨細胞數(shù)下降、破骨細胞數(shù)上升，說明骨形成減少，骨吸收相對大于骨形成[6]。但是體內實驗可控制的因素太少，而影響因素較多，因此無法說明以血糖升高為特征的糖尿病對骨代謝的影響，也使得臨床觀察實驗得到的結果差異很大[7-10]。為此，單純的體外實驗，就葡萄糖對骨形成的影響進行觀察是非常必需的。在本研究中，我們設置了4種不同葡萄糖濃度的培養(yǎng)基，從細胞的增殖、分泌活性產物的能力、凋亡以及礦化能力各個方面觀察了葡萄糖對體外培養(yǎng)的人成骨細胞的影響。

骨鈣素(BGP)是成骨細胞合成和分泌的一種非膠原蛋白，主要沉積于骨基質中，其主要生理作用是維持骨的礦化速度，直接反映成骨細胞活性，是反映骨形成的指標[11]，可釋放至血中，血清BGD水平與骨中BGD的含量呈正相關。我們采用RIA法測定了不同組別BGD分泌量，我們發(fā)現(xiàn)BGD分泌量在生理劑量組時最大，高于其他各組。隨著葡萄糖濃度的升高，實驗各組BGP分泌量沒有明顯差異。

通過研究，我們發(fā)現(xiàn)隨著葡萄糖濃度升高，成骨細胞增殖率、凋亡率升高，但是濃度過高(40 mmol/l 對細胞增殖沒有促進作用。ALP分泌能力在10 mmol/L時最強，而BGP分泌能力在5.51 mmol/L時最強。

總之，本研究表明，升高的葡萄糖濃度對細胞的增殖具有一定的促進作用，但增多的細胞數(shù)量并沒有帶來相應細胞活性的增加。相反，細胞分泌ALP和BGP的能力不同程度的出現(xiàn)了下降，且細胞凋亡比率增加。證實了高糖環(huán)境的毒性作用，特別是對細胞分泌能力的抑制。

參考文獻：

[1]Balint E, Szabo P, Marshall CF, et al. Glucose-induced inhibition of in vitro bone mineralization[J].Bone,2001,28(1):21-28.

[2]蘇友新，陳智能，楊連梓等.梯度糖溶液對體外培養(yǎng)成骨細胞影響的實驗研究[J].中華骨傷，2005,19(7)：407-409.

[3]Majd Z, Sergiu B, Laura RM. P38 and activating transcriptionfactor-2 involvement in osteoblast osmotic response to elevated extracellular glucose[J]. J Biol Chem, 2002,277 (40):37212-37218.

[4]Zayzafoon M, Stell C, Irwin R, et al. Extracellular glucose influences osteobast differentiation and c-Jun expression[J].JCell Biochem,2000,79(2):301-310.

[5]鄭志永， 楊久山， 畢榮修等， 人成骨細胞的離體培養(yǎng)和鑒定[J].中國醫(yī)學工程，2006:8(14)：8-9.

[6]徐浩， Eichstaedt H. 肝移植術后骨質疏松癥患者骨代謝的改變[J]. 中華器官移植雜志， 1999,20:248.

[7]Hanley DA, Brown JP, Tenenhouse A,et al. Associationsamong disease conditions, bone mineral density, and prevalentvertebral deformities in men and women 50 years of age andolder:cross-sectional results from the Canadian multicentreosteoporosis study[J].JBMR,2003,18(4):784-790.

[8]Akin O, Gol K,Akturk M,et al. Evaluation of bone turnoverin postmenopausal patients with type 2 diabetes mellitus usingbiochemical markers and bone mineral density measurements [J].Gynecol Endocrinol,2003, 17(1):19-29.

[9]Al-Maatouq MA, El-Desouki MI, Othman SA,et al. Prevalence of osteoporosis among postmenopausal females withdiabetes mellitus[J]. Saudi Med J,2004, 25(10):1423-1427.

[10]林華， 王新.糖尿病骨質疏松的研究進展[J].江蘇醫(yī)藥， 1995 (10)：679-680.

[11]CROFTOM P M,WADE J C, TAYLOR M R H.Serum concentracim of carboxylterminal propeptide of type Ⅰ procollagen, a min-telopeptide of type Ⅲ procollagen, cross-linked arboxyl-terminal telopptide of Ⅰ collagen, andtheir interrelationships in school children[J].Clin Chen, 1997,43:1577-1581.

The influence of different glucose concentrattion on cellular activiity of human osteoblast cell

LIZhi-hai

(Juancheng People Hospital， Juancheng 274600，China)

Abstract:Objective: In this research ,we took an insight into the influence of different glucose concentrations on human Osteoblast cell, hoping to give an explanation to the mechanism of the osteoporosis (OP) caused by diabetes mellitus (DM). Methods： Four culture media of different glucose concentration (5.5 , 10, 20 or 40 mmol/L) were set up for this study . Human Osteoblast cell was cultured in these media successively for 3~12 d, and then the proliferation rate of cells, secretion of ALP and BGP, percentage of apoptosis cells were observed and measured .Results： within a certain glucose concentration, the elevated glucose concentration prompted the proliferation of Osteoblast cells, but the activities of Osteoblast cells were not correspondent with the cell number .On the contrary, the secretion of ALP and BGP of the Osteoblast cells were decreased .The apoptosis of the cells was promoted .Conclusion： From our study, we confirmed the hyperglycemia can inhibit the secretion ability of Osteoblast cells.

Key words:glucose; osteoporosis; human osteoblast Cell; ALP; BGP

(收稿日期2015-11-16)

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2016.02.005

中圖分類號：R681

文獻標識碼：A

文章編號：1004-7115(2016)02-0133-03

*作者簡介：李志海(1977—)，男，山東鄆城人，主治醫(yī)師，本科，主要從事臨床骨科工作。