李勝男　李　偉　周冬梅

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇　徐州　221000)

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血糖波動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠小腸上皮細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制

李勝男李偉周冬梅

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇徐州221000)

〔摘要〕目的探討血糖波動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制。方法用鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo),間斷短效胰島素應(yīng)用輔助高糖高脂飲食制備2型糖尿病(T2DM)血糖波動(dòng)模型。12 w后，檢測(cè)大鼠血清丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)活性；TUNEL法檢測(cè)小腸上皮細(xì)胞凋亡，免疫組化法檢測(cè)凋亡基因Bcl-2、Bax的表達(dá)。結(jié)果血糖波動(dòng)組大鼠MDA水平、SOD活性與正常組、持續(xù)性高血糖組比較差異顯著(P<0.05)；持續(xù)高血糖組大鼠小腸上皮可見少數(shù)陽(yáng)性凋亡細(xì)胞表達(dá),與正常組相比明顯增多(P<0.05)；血糖波動(dòng)組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞較持續(xù)高血糖組增多更加明顯(P<0.01)。血糖波動(dòng)組、持續(xù)高血糖組Bcl-2的表達(dá)較正常組顯著下降，Bax顯著升高(P<0.05),血糖波動(dòng)組Bcl-2的表達(dá)較持續(xù)高血糖組進(jìn)一步下降,Bax進(jìn)一步升高(P<0.05)。結(jié)論糖尿病大鼠血糖波動(dòng)可明顯加速小腸上皮細(xì)胞凋亡。腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡與血糖波動(dòng)所致的氧化應(yīng)激有關(guān),Bcl-2/Bax參與氧化應(yīng)激的過(guò)程。

〔關(guān)鍵詞〕血糖波動(dòng)；凋亡；小腸；氧化應(yīng)激；糖尿病

高血糖是糖尿病(DM)的標(biāo)志，也是導(dǎo)致DM慢性并發(fā)癥的主要因素，臨床表現(xiàn)為慢性波動(dòng)性高血糖與慢性持續(xù)性高血糖。有研究顯示〔1〕，血糖波動(dòng)可通過(guò)不同途徑產(chǎn)生活性氧(ROS),誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng),并介導(dǎo)凋亡基因的改變，造成組織、細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能障礙,導(dǎo)致DM并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。有關(guān)血糖波動(dòng)對(duì)機(jī)體腸道的影響少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)建立2型糖尿病(T2DM)大鼠血糖波動(dòng)模型，深入探討血糖波動(dòng)下小腸上皮黏膜細(xì)胞凋亡情況及氧化應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)情況。

1材料與方法

1.1建模和分組選用清潔級(jí)2月齡雄性SD大鼠45只〔徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心,合格證號(hào):SCXK(蘇)2013-007〕。高糖高脂飼料配方為66.5%普通飼料，20%蔗糖，10%豬油，2.5%膽固醇，1%豬膽鹽，由徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心配制。將45只雄性SD大鼠隨機(jī)分成2組：正常組(n=15)；模型組(n=30)。模型組用鏈脲佐菌(STZ,Sigma)35 mg/kg腹腔注射,48 h血糖≥16.7 mmol/L成模,將26只成模大鼠分成2組：①持續(xù)高血糖組(S組)14只,繼續(xù)高脂高糖飲食，不予任何治療；②血糖波動(dòng)組(F組)12只,每日皮下注射1次普通胰島素12~16 U,根據(jù)血糖調(diào)整胰島素劑量,血糖10~20 mmol/L。飲食同S組。另15只未用STZ大鼠為對(duì)照組(N組),予普通飲食，3組大鼠均不限制飲水。S組和N組同時(shí)皮下注射等量生理鹽水。每周測(cè)血糖2 d,每天4次、滿12 w處死。

1.2取材連續(xù)觀察12 w后收集標(biāo)本。稱量體重后，用10%水合氯醛按3～3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心15 min后保存于-80℃冰箱，測(cè)血紅蛋白(HbA1c)(層析法)；開腹取距回盲部2 cm處回腸組織，生理鹽水沖洗，行石蠟包埋，免疫組織化學(xué)。

1.3形態(tài)學(xué)光鏡觀察將石蠟包埋的小腸組織切片行蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察損傷程度。

1.4細(xì)胞凋亡用TUNEL法,按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。檢測(cè)小腸組織切片中凋亡細(xì)胞的核酸斷裂片段并計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)。結(jié)果判斷：以腸上皮細(xì)胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)棕色顆粒為陽(yáng)性．光鏡下計(jì)數(shù)每100個(gè)上皮細(xì)胞中凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)，每張切片任選5個(gè)視野，求其平均值。

1.5免疫組化檢測(cè)Bcl-2、Bax采用ABC法,實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行,DAB顯色。每張切片隨機(jī)選擇2~3個(gè)視野(×400),采用美國(guó) IPP5.0(Image-Pro plus)彩色圖像分析系統(tǒng)測(cè)定其吸光度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素分析、LSD及q檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1體重、血糖、HbA1c測(cè)定實(shí)驗(yàn)前，3組大鼠體重比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；造DM模型后，S組、F組與N組比較差異顯著(P<0.01),S組和F組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；造血糖波動(dòng)模型后即處死前，S組、F組和N組比較，差異顯著(P<0.01),F組和S組比較差異顯著(P<0.05)。與N組相比,S組大鼠血糖水平明顯增高(P<0.05),即12 w內(nèi)穩(wěn)定處于高水平,而N組大鼠血糖則始終處于正常范圍內(nèi)。F組24 h血糖波動(dòng)較大,計(jì)算每組大鼠血糖變異系數(shù)(CV值),結(jié)果顯示CV與N組、S組比較差異顯著(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),F組和S組HbA1c均顯升高,與N組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；F組和S組之間HbA1c水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2血清丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)活性比較F組及M組大鼠血清MDA水平及SOD活性與N組比較，差異顯著(P<0.01)；F組大鼠血清MDA、SOD水平值與M組比較差異顯著(P<0.05)，見表2。

表1　各組大鼠體重及血糖的變化±s)

與N組比較：1)P<0.01；與S組比較：2)P<0.05，下表同

表2　各組大鼠血清MDA、SOD水平比較

2.3光鏡下N組回腸黏膜顯示規(guī)則的絨毛，有刷狀緣，絨毛上皮細(xì)胞核呈柱狀，排列整齊；S組回腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)斷裂，絨毛高度降低，組織充血，黏膜及黏膜下層伴有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，絨毛上皮細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則；F組較S組更加明顯。見圖1。

2.4免疫組化染色結(jié)果3組大鼠Bax、Bcl-2在小腸上皮黏膜細(xì)胞均有陽(yáng)性；光鏡下可見小腸黏膜上皮細(xì)胞Bax在胞質(zhì)中棕褐色表達(dá)，胞質(zhì)中有許多細(xì)小顆粒結(jié)構(gòu)，胞核不著色，各組著色強(qiáng)度不一；S組Bax蛋白表達(dá)較N組明顯升高，F(xiàn)組較S組升高；F組Bcl-2蛋白表達(dá)較N組明顯下降，F(xiàn)組較S組下降。見圖2。

2.5TUNEL檢測(cè)TUNEL染色可見細(xì)胞核呈棕褐色反應(yīng)的陽(yáng)性凋亡細(xì)胞,胞核內(nèi)染色質(zhì)濃縮形成密集顆粒位于核膜下,有的胞核被降解,胞質(zhì)不著色。S組大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞AI明顯高于N組(P<0.01)，F(xiàn)組高于S組(P<0.05)。見圖3，表3。

圖1　各組大鼠小腸黏膜組織形態(tài)學(xué)(HE，×400)

圖2　各組大鼠小腸組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)(SABC法，×400)

組別nAI凋亡率(%)N組125.8±6.518.28±6.02S組1221.98±7.131)32.81±5.801)F組1036.16±5.161)2)48.64±7.231)2)

圖3　各組大鼠小腸組織細(xì)胞凋亡情況(TUNEL，×400)

3討論

氧化應(yīng)激是指反應(yīng)性氧簇 (ROS)產(chǎn)生增多和(或)清除減少,導(dǎo)致ROS在體內(nèi)蓄積而引起的分子、細(xì)胞和機(jī)體的損傷〔2〕。已有研究顯示血糖波動(dòng)可通過(guò)不同途徑產(chǎn)生ROS,誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng),造成組織、細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能障礙,導(dǎo)致DM并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展〔3〕。本研究發(fā)現(xiàn)血糖波動(dòng)大鼠血清MDA水平及SOD活性顯著高于血糖持續(xù)大鼠，反映血糖波動(dòng)促進(jìn)機(jī)體出現(xiàn)顯著的氧化應(yīng)激反應(yīng)。Ge等〔4〕將豬腸內(nèi)皮細(xì)胞置于波動(dòng)性高血糖和持續(xù)性高血糖中，相比持續(xù)性高血糖，NADPH氧化酶活性明顯增高，在某種程度上細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)物與增強(qiáng)的NADPH活性有關(guān)。本研究結(jié)果與既往研究一致。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞配體與細(xì)胞死亡受體結(jié)合或細(xì)胞損傷誘導(dǎo)各種水解酶激活，導(dǎo)致細(xì)胞蛋白分解、DNA碎裂、染色體積聚等一系列受嚴(yán)格調(diào)控的病理生理過(guò)程〔5〕。高血糖可引起腸道組織結(jié)構(gòu)和功能改變。DM可引起腸道上皮細(xì)胞凋亡。有研究顯示〔6〕，應(yīng)激狀態(tài)下腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激水平與其凋亡程度呈正相關(guān),氧化應(yīng)激可導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞凋亡調(diào)控基因與蛋白表達(dá)的變化，腸上皮細(xì)胞凋亡水平的變化可能與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的失衡有關(guān),Bcl-2基因家族參加腸道上皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生，Bcl-2和Bax蛋白水平高低與凋亡直接相關(guān)，Bax的表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而bcl能抑制凋亡。Jafari等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)，DM大鼠Bax/Bcl-2表達(dá)增加，Caspase-3活性增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡增加。李偉等〔8〕發(fā)現(xiàn)血糖波動(dòng)可明顯加速DM大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，引起B(yǎng)cl-2、Bax異常表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)組和S組較N組而言其Bax含量顯著升高，Bcl-2含量顯著減低，與S組比F組大鼠小腸上皮細(xì)胞中Bax表達(dá)顯著增加。而Bcl-2的表達(dá)較M組明顯減少。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)同時(shí)觀察到血糖波動(dòng)組大鼠小腸上皮細(xì)胞出現(xiàn)核染

色質(zhì)濃縮和邊集等凋亡的早期表現(xiàn)更加明顯,本研究認(rèn)為細(xì)胞凋亡參與了上述DM腸道上皮損壞的病理過(guò)程,血糖波動(dòng)作為一種獨(dú)立危險(xiǎn)因素誘導(dǎo)Bax蛋白的表達(dá),介導(dǎo)了Bcl-2的裂解,促使Bax/Bcl-2的比值升高,破壞線粒體膜,放大死亡信號(hào),使細(xì)胞最終不可逆的走向凋亡〔9〕。結(jié)果支持血糖波動(dòng)可能具有直接促凋亡的作用，提示DM大鼠血糖波動(dòng)可加重其腸道損傷。目前對(duì)于這種波動(dòng)性血糖較持續(xù)者更為嚴(yán)重的機(jī)制尚不清楚。Monnier等〔10〕的臨床研究表明波動(dòng)性高血糖較持續(xù)性高血糖更能激活DM患者的氧化應(yīng)激；在慢性高血糖狀態(tài)下，機(jī)體可通過(guò)一定程度的適應(yīng)能力調(diào)節(jié)代謝，使其發(fā)生改變來(lái)部分對(duì)抗葡萄糖的毒性效應(yīng)，而波動(dòng)性高血糖則這種適應(yīng)能力受損，引起嚴(yán)重的糖毒性效應(yīng)。因此，減少血糖波動(dòng)，逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激對(duì)組織細(xì)胞的損害,可能會(huì)對(duì)DM及其并發(fā)癥的防治起到重要的作用。

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〔2014-12-03修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

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〔中圖分類號(hào)〕R587.1

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)07-1598-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.027

通訊作者：李偉(1957-)，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事內(nèi)分泌疾病發(fā)病機(jī)制研究。

第一作者：李勝男(1988-)，女，碩士，主要從事糖尿病并發(fā)癥的診斷及治療研究。