謝亞芹，趙娟，李秀華，馮翔宇

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福辛普利對慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響

謝亞芹，趙娟，李秀華，馮翔宇

摘要

關(guān)鍵詞福辛普利；心力衰竭；細(xì)胞凋亡；凋亡相關(guān)基因

作者單位:067000 河北省承德市，承德醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室(謝亞芹、趙娟)； 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 老年病科(李秀華、馮翔宇)

Effect of Fosinppril on Myocardial Cell Apoptosis and Apoptosis-associated Gene Expression in Chronic Heart Failure Rats

XIE Ya-qin,ZHAO Juan,LI Xiu-hua,FENG Xiang-yu.
Department of Pathophysiology,Chengde Medical College,Chengde(067000),Hebei,China
Corresponding Author:XIE Ya-qin,Email:xieyq1983@126.com

Abstract

Objective:To investigate the effects of fosinppril on myocardial cell apoptosis and apoptosis-associated gene expression in chronic heart failure(CHF)rats.

Methods:CHF model was established by partially banding of abdominal aorta superior to renal artery.The experimental rats were randomly divided into 3 groups:Sham operation group and CHF group,the rats in both groups received stomach normal saline;Fosinopril group,the rats received stomach fosinopril 10 mg/kg?d.n=10 in each group and all animals were treated for 8 weeks.LVEDP,±dp/dtmaxand LVMI were examined,left ventricular myocardial cell apoptotic index(AI)was measured by TUNEL method,Bcl-2 and Bax protein levels were detected by immunohistochemistry and caspase-3 protein expression was assessed by Western blotting.

Results:Compared with Sham operation group,CHF group had increased LVEDP,LVMI,AI,elevated protein expressions of Bax and Caspase-3,P<0.01;while decreased ±dp/dtmax,reduced protein expression of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax,P<0.01.Compared with CHF group,Fosinopril group presented decreased LVEDP,LVMI,AI,reduced protein expressions of Bax and Caspase-3,P<0.01;while increased ±dp/dtmax,elevated protein expression of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax,P<0.01.Conclusion:Fosinopril may inhibit myocardial cell apoptosis which occurred during CHF,by up-regulating Bcl-2 expression and down-regulating expressions of Bax and Caspase-3 in CHF rats,therefore improve the cardiac function.

Key words Fosinopril;Hear failure;Apoptosis;Apoptosis-associated gene

(Chinese Circulation Journal,2016,31:285.)

慢性心力衰竭是各種病因?qū)е滦呐K疾病的嚴(yán)重階段及最終歸宿，也是心臟疾病患者最主要的死亡原因。近年來有研究證明[1]，長效血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）類藥物在治療高血壓的同時可使心肌肥厚逆轉(zhuǎn)，使擴(kuò)大的心臟恢復(fù)正常，降低心臟負(fù)荷，改善心室功能，降低心力衰竭的死亡率。但其能否有效抑制長期慢性壓力超負(fù)荷引起的心力衰竭心肌細(xì)胞凋亡仍需進(jìn)一步研究。本研究將以腎上腹主動脈縮窄方式建立慢性壓力負(fù)荷型心力衰竭動物模型，分析福辛普利對慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的影響，探討其在積極逆轉(zhuǎn)心肌受損，改善心力衰竭進(jìn)程中的作用，為臨床藥物治療的研究提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

材料： 2014-01至2015-01選取清潔級雄性Wistar大鼠35只,購自北京華阜康生物科技股份有限公司（合格證編號：2009-0004）；福辛普利(10 mg)商品名：蒙諾，購自中美上海施貴寶制藥有限公司；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國羅氏（Roche）公司；B細(xì)胞白血病/淋巴瘤相關(guān)抗原2（Bcl-2）、B細(xì)胞白血病/淋巴瘤相關(guān)抗原相關(guān)X（Bax）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 （Caspase-3）兔抗多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；SP免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；二奎啉甲酸（BCA）法蛋白定量試劑盒購自北京泰格美科技有限公司。

動物模型的建立及分組：將35只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取10只作為假手術(shù)組，假手術(shù)組只分離腹主動脈而不結(jié)扎。其余25只大鼠全部采用腎上腹主動脈縮窄手術(shù)建立慢性心力衰竭模型[2,3]。術(shù)后均給予青霉素20萬U連續(xù)3天腹腔注射，常規(guī)喂養(yǎng)6周，造模大鼠逐漸出現(xiàn)呼吸、心跳加快、倦怠無力、食欲減退等表現(xiàn)，模型建立中死亡5只。檢測血流動力學(xué)參數(shù)，以左心室舒張末壓（LVEDP）≥15 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）作為成模標(biāo)準(zhǔn)，待成功建立模型后，福辛普利組（n=10）大鼠給予福辛普利10 mg/（kg·d），慢性心力衰竭組（n=10）和假手術(shù)組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)8周。

血流動力學(xué)監(jiān)測：將大鼠測體重后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.5 g/kg）大鼠，經(jīng)右頸總動脈逆行插管至左心室，另一端接壓力換能器輸入多媒體生物信號記錄儀系統(tǒng)，記錄分析后獲得LVEDP，左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率（±dp/dtmax)等。

標(biāo)本制備及計算左心室質(zhì)量指數(shù)（LVMI）：福辛普利治療結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.5 g/kg）大鼠，進(jìn)行血流動力學(xué)監(jiān)測后，迅速開胸取出心臟，冰生理鹽水洗凈，分離左心室，取左心室稱重后，將部分放入4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋，備用于免疫組織化學(xué)染色檢測Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)；其余左心室迅速投入液氮中保存，備用于蛋白免疫印記法（Western blotting）檢測Caspase-3蛋白表達(dá)。LVMI=大鼠左心室質(zhì)量/大鼠體重。

TUNEL法原位檢測細(xì)胞凋亡：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，蛋白酶K（proteinase K）工作液消化15 min，TUNEL反應(yīng)液37℃孵育60 min，過氧化物酶（POD）轉(zhuǎn)化劑37℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕褐色著染。凋亡指數(shù)（AI）的確定：以TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目與同一視野心肌細(xì)胞總數(shù)的比值作為左心室心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，每只動物任選3張切片，每張切片選取4個視野，取平均值。

免疫組織化學(xué)檢測Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)：采用SP免疫組織化學(xué)染色方法檢測左心室心肌組織Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)。Ⅰ抗分別為Bcl-2、Bax多克隆抗體，稀釋濃度均為1:100。實驗同時以0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）代替第1抗體作為陰性對照，以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)在10×20倍顯微鏡下對免疫陽性結(jié)果進(jìn)行半定量分析，以免疫陽性產(chǎn)物面積與視野面積的比值表示該抗原的相對含量。每只動物任選3張切片，每張切片選取4個視野，取平均值。

Western blotting檢測Caspase-3蛋白表達(dá)：稱取左心室心肌組織，BCA蛋白試劑盒測定總蛋白含量[4]。取蛋白質(zhì)樣品每份100μg，與5×loading buffer混勻，100℃煮沸5min，12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜，在麗春紅染液中染色觀察蛋白轉(zhuǎn)移情況并標(biāo)出蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，然后用含5%脫脂牛奶的0.5‰TBST封閉緩沖液（含有Tris-HCl、NaCl、Tween-20，pH=8.0）中封閉，4℃過夜，洗膜后加入1:200羊抗Caspase-3多克隆抗體、1:1 000小鼠抗β肌動蛋白（β-actin）進(jìn)行雜交，再洗膜后加辣根酶標(biāo)記的相應(yīng)的二抗（工作濃度1:5 000）進(jìn)行雜交，洗膜后加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑最后進(jìn)行放射自顯影。膠片掃描后，采用Quantity One-v 4.6.2軟件對顯影條帶進(jìn)行分析，計算Caspase-3條帶與β-actin條帶灰度比值，作為Caspase-3蛋白表達(dá)的相對水平。

2　結(jié)果

血流動力學(xué)參數(shù)及LVMI檢測結(jié)果（表1）：與假手術(shù)組相比，慢性心力衰竭組大鼠LVEDP、LVMI顯著增高（P<0.01），±dp/dtmax明顯下降（P<0.01）；與慢性心力衰竭組相比，福辛普利組大鼠LVEDP、LVMI明顯下降（P<0.01）、±dp/dtmax明顯上升（P<0.01）,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

心肌細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果（表2、圖1）：TUNEL陽性產(chǎn)物位于胞核，呈棕褐色顆粒狀。與假手術(shù)組比較，慢性心力衰竭組大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡明顯增多，AI明顯增高（P<0.01）；與慢性心力衰竭組比較,福辛普利組大鼠心肌組織細(xì)胞AI明顯降低（P<0.01），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

免疫組織化學(xué)法檢測心肌組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)結(jié)果（圖2、3，表2）：Bcl-2和Bax免疫陽性產(chǎn)物呈棕黃色，位于心肌細(xì)胞漿。與假手術(shù)組相比，慢性心力衰竭組大鼠心肌組織Bax蛋白表達(dá)明顯增高（P<0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比值明顯降低（P<0.01）。與慢性心力衰竭組相比，福辛普利組大鼠心肌組織Bax蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比值顯著升高（P<0.01），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1　各組大鼠血流動力學(xué)參數(shù)及LVMI比較（n=10，±s）

表2　各組大鼠左心室心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)及心肌組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)（n=10，±s）

圖1　缺口末端標(biāo)記法檢測各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡(×200)

圖2　免疫組化染色檢測各組大鼠左心室心肌組織Bcl-2蛋白表達(dá)(×200)

圖3　免疫組化染色檢測各組大鼠左心室心肌組織Bax蛋白表達(dá)(×200)

Western blotting法檢測Caspase-3蛋白的表達(dá)結(jié)果（圖4）：慢性心力衰竭組大鼠心肌組織Caspase-3蛋白表達(dá)水平為0.66±0.08，與假手術(shù)組0.22±0.03比較明顯增高（P<0.01），福辛普利組Caspase-3蛋白表達(dá)水平為0.45±0.05，與慢性心力衰竭組比較顯著降低（P<0.01），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖4　蛋白免疫印記法檢測各組大鼠左心室心肌組織Caspase-3蛋白表達(dá)

注：1：假手術(shù)組；2：慢性心力衰竭組；3：福辛普利組。Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；β-actin：β肌動蛋白

3　討論

目前研究表明[5]，心肌細(xì)胞的凋亡在心力衰竭的病理改變中有著重要的作用。慢性心力衰竭發(fā)生時左心室功能的不斷惡化是心肌細(xì)胞凋亡或（和）剩余的心肌細(xì)胞收縮功能代償不足的結(jié)果，而凋亡可能是心肌細(xì)胞不斷丟失的根源所在[6]。本研究中血流動力學(xué)檢測結(jié)果，LVEDP水平明顯升高，+dp/dtmax與-dp/dtmax均降低，表明慢性心力衰竭組大鼠明顯出現(xiàn)心功能的惡化，同時LVMI增加，提示慢性心力衰竭組大鼠左心室壁增厚，出現(xiàn)心肌肥厚。TUNEL檢測顯示慢性心力衰竭組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高。因此提示在慢性壓力負(fù)荷增加時，可發(fā)生心肌細(xì)胞的凋亡及心肌纖維化，并最終導(dǎo)致心功能的惡化。

心肌細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的細(xì)胞主動死亡過程，目前已知的凋亡調(diào)節(jié)蛋白中，Bcl-2家族與Caspase家族為最關(guān)鍵的兩大類[7]。Bcl-2是一種抑制細(xì)胞凋亡的基因，而Bax是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因。Bcl-2與Bax形成的異源二聚體中兩者的比例決定促進(jìn)細(xì)胞凋亡還是抑制凋亡[8]。因此，兩種基因在細(xì)胞中含量和功能之間的平衡一直被認(rèn)為是決定促凋亡因素刺激后細(xì)胞的存活或死亡重要機(jī)制[9]，所以Bcl-2 和Bax是調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因。本研究發(fā)現(xiàn)慢性心力衰竭組大鼠與假手術(shù)組比較，Bax表達(dá)明顯升高，Bcl-2表達(dá)及Bcl-2/Bax比值顯著降低，提示Bcl-2、Bax確實在心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

Caspase-3被認(rèn)為是各種凋亡刺激因子激活的Caspase家族中的關(guān)鍵蛋白酶，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，其活化標(biāo)志著凋亡進(jìn)入不可逆階段[10]?，F(xiàn)已證實Caspase-3在心、腦等重要器官缺血再灌注過程及腫瘤細(xì)胞[11]均異常表達(dá)，參與細(xì)胞凋亡。本研究顯示發(fā)現(xiàn)慢性心力衰竭組大鼠與假手術(shù)組比較，Caspase-3蛋白的表達(dá)均明顯升高，提示Caspase-3在壓力負(fù)荷型慢性心力衰竭心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用。

ACEI類藥物能使血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）生成減少，并使神經(jīng)內(nèi)分泌激素和AngⅡ介導(dǎo)的進(jìn)行性左心室肥大和擴(kuò)張受到抑制，增加前列腺素的生成，從而抑制心室重構(gòu)，被認(rèn)為是治療慢性心力衰竭的基石[12]。但大多是ACEI是前體藥物，生物利用度較低。福辛普利作為第三代長效ACEI類藥物，具有作用時間更長，副作用減少，肝腎雙重排泄等優(yōu)點，因此其在心血管疾病及腎臟損害的治療等方面得到了越來越多的關(guān)注[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在福辛普利的作用下，慢性心力衰竭大鼠的心功能得到明顯改善，并抑制了心肌肥厚的發(fā)生。同時，福辛普利的治療使心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、Bax、Caspase-3的表達(dá)明顯低于慢性心力衰竭組大鼠，Bcl-2表達(dá)及Bcl-2/Bax比值較慢性心力衰竭組顯著升高。這表明福辛普利通過上調(diào)抑制凋亡基因Bcl-2表達(dá)、下調(diào)促凋亡基因Bax、Caspase-3表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞的凋亡，改善心室功能。

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(編輯:汪碧蓉)

基礎(chǔ)與實驗研究

(收稿日期:2015-04-28)

中圖分類號：R541.6

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3614（2016）03-0285-04

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.03.019

作者簡介:謝亞芹 講師 碩士 研究方向：慢性心力衰竭的發(fā)病機(jī)制與治療 Email：xieyq1983@126.com 通訊作者:謝亞芹

基金項目:河北省高校省級重點學(xué)科（病理學(xué)與病理生理學(xué)） 項目

目的： 探討福辛普利對慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響。

方法： 采用腎上腹主動脈縮窄法建立大鼠慢性心力衰竭模型，隨機(jī)分為假手術(shù)組、慢性心力衰竭組、福辛普利組，每組10只大鼠。術(shù)后假手術(shù)組和慢性心力衰竭組給予生理鹽水灌胃，福辛普利組給予福辛普利10 mg/（kg·d）灌胃。8周后，觀察各組大鼠左心室舒張末壓（LVEDP）、左心室內(nèi)壓最大上升及下降速率（±dp/dtmax）和左心室質(zhì)量指數(shù)（LVMI）；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測大鼠左心室心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)（AI）；SP免疫組織化學(xué)染色法檢測左心室心肌組織B細(xì)胞白血病/淋巴瘤相關(guān)抗原2（Bcl-2）、B細(xì)胞白血病/淋巴瘤相關(guān)抗原相關(guān)X（Bax）蛋白的表達(dá)；蛋白免疫印記法（Western blotting） 檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）蛋白的表達(dá)。

結(jié)果： 慢性心力衰竭組與假手術(shù)組相比，大鼠LVEDP、LVMI 、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、Bax蛋白、Caspase-3蛋白的表達(dá)均明顯升高（P<0.01），±dp/dtmax、Bcl-2蛋白的表達(dá)、Bcl-2/Bax比值顯著下降（P<0.01）；與慢性心力衰竭組比較，福辛普利組大鼠LVEDP、LVMI、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、Bax蛋白、Caspase-3蛋白的表達(dá)均明顯降低（P<0.01），±dp/dtmax、Bcl-2蛋白的表達(dá)、Bcl-2/Bax比值顯著升高（P<0.01）,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)論： 慢性心力衰竭過程中發(fā)生了心肌細(xì)胞凋亡，福辛普利可通過上調(diào)Bcl-2的表達(dá)及下調(diào)Bax及Caspase-3的表達(dá)抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善慢性心力衰竭大鼠心室功能及心肌肥厚。