王碩，龐曉，曹慧

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苯腎上腺素對心肌纖維化的調(diào)節(jié)和對白細胞介素-1、白細胞介素-6及腫瘤壞死因子-α的影響

王碩，龐曉，曹慧

摘要

關(guān)鍵詞腎上腺素α1受體激動劑；心肌纖維化；白細胞介素-1；白細胞介素-6；腫瘤壞死因子-α

作者單位：832002 新疆維吾爾自治區(qū)石河子市，石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 心內(nèi)科

Impacts of Phenylephrine on Myocardial Fibrosis Regulation and Interleukin-1,Interleukin-6,Tumor Necrosis Factor-α Expressions in Experimental Mice

WANG Shuo,PANG Xiao,CAO Hui.
Department of Cardiology,First Affiliated Hospital of Shihezi University Medical College,Shihezi(832002),Xinjiang,China
Corresponding Author:PANG Xiao,Email:px0993@163.com

Abstract

Objective:To explicit phenylephrine(PE),α1-adrenergic receptor(α1-AR)on myocardial fibrosis regulation and interleukin-1(IL-1),IL-6,tumor necrosis factor-α(TNF-α)expressions in pressure overloaded mice.

Methods:A total of 49 KM mice were randomly divided into 3 groups:Blank control group,n=7,Sham operation group,n=7,Transverse abdominal aortic constriction(TAC)group,n=35,and 8 weeks later,the mice in TAC group were further divided into 5 sub-groups as TAC control,TAC+PE,TAC+Praz,TAC+Prop,TAC+Carv sub-groups,n=5 in each sub-group,and the animals were respectively treated for 3 weeks.Left ventricular collagen volume fraction(CVE),hydroxyproline content and IL-1,IL-6,TNF-α expressions were examined respectively.

Results:By 8 weeks treatment,compared with Blank control group,TAC group had obvious myocardial fibrosis,increased hydroxyproline content and IL-1,IL-6,TNF-α expressions,P<0.001.Compared with TAC control sub-group,TAC+PE,AC+Prop,TAC+Carv sub-groups showed decreased CVF,hydroxyproline content and IL-1,IL-6,TNF-α expressions,P<0.001,while the above changes were not obvious in TAC+Praz sub-group,P>0.05;CVE and hydroxyproline content were similar between TAC+PE and TAC+Prop sub-groups,while the expressions of IL-1,IL-6 and TNF-α were obviously decreased in TAC+Prop sub-group,P<0.05.Conclusion:PE may improve myocardial fibrosis and IL-1,IL-6,TNF-α expressions by activating α1-AR in pressure overloaded mice,α1-AR might be a defending factor for myocardial fibrosis.

Key words Adrenergic alpha-1 receptor agonists;Myocardial fibrosis;Interleukin-1;Interleukin-6;Tumor necrosis factor-α

(Chinese Circulation Journal,2016,31:289.)

心肌纖維化是指在正常的心臟組織結(jié)構(gòu)中膠原纖維過量積聚、膠原濃度顯著升高或膠原成分發(fā)生變化，是膠原合成代謝和分解代謝失衡的結(jié)果。這種病理表現(xiàn)存在于多種心血管疾病，與心功能障礙、心律失常甚至心原性猝死密切相關(guān)。交感神經(jīng)系統(tǒng)活性增加在心血管病的發(fā)生、發(fā)展中有著重要的作用[1]?；A(chǔ)實驗與臨床研究已證實，β腎上腺素能受體（β-AR）阻滯劑能夠延緩心血管病進展，降低心力衰竭的發(fā)病率和死亡率[2]，但是，與β-AR在心臟中的作用已受到廣泛關(guān)注不同，有關(guān)α1腎上腺素能受體（α1-AR）的研究報道較少。

炎癥因子在多種疾病所致的心肌纖維化進程中起著重要作用。各種致病因素導致心肌組織炎性細胞浸潤、炎癥因子水平異常增高，刺激心臟膠原纖維合成增多，最終導致心肌纖維化。急性心肌梗死后的梗死區(qū)和非梗死區(qū)都存在炎性細胞浸潤和心肌纖維化，且炎癥因子的水平與纖維化的程度密切相關(guān)。炎癥因子在心肌纖維化過程中形成了一個復雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡，在炎癥因子的刺激下，發(fā)生纖維化的心肌組織進一步分泌炎癥因子，從而導致惡性循環(huán)。

本實驗通過腹主動脈縮窄（TAC）誘導小鼠壓力超負荷模型，在小鼠出現(xiàn)心肌纖維化后，分別予α1-AR激動劑苯腎上腺素（PE）、α1-AR抑制劑哌唑嗪（Praz）、β1/β2受體阻滯劑普萘洛爾（Prop）和α1/β1/β2受體阻滯劑卡維地洛（Carv）處理，明確α1-AR在心肌纖維化過程中的作用，并且觀察炎癥因子白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在α1-AR調(diào)節(jié)的心肌纖維化過程中的變化。

1　材料與方法

實驗動物及分組：昆明（KM）小鼠49只，雄性，8周齡，體重22～25 g，購自新疆石河子大學實驗動物中心。實驗室喂養(yǎng)適應1周后，記錄體重、活動狀態(tài)作為基線資料，隨后將動物隨機分為3組：（1）TAC組（n=35）：分離小鼠腹主動脈，在腎臟水平用6號手術(shù)線將腹動脈和0.18 mm針頭一起結(jié)扎；（2）假手術(shù)組（n=7）：只分離腹主動脈，不結(jié)扎；（3）空白對照組（n=7）。8周后重新記錄體重、活動狀態(tài)，將TAC組隨機分為5組，每組7只：TAC+PE組（每日PE 0.65 mg/kg腹腔注射）、TAC+Praz組（每日Praz 5 mg/kg灌胃）、TAC+Prop組（每日Prop 40 mg/kg灌胃）、TAC+Carv組（每日Carv 10 mg/kg灌胃）和TAC對照組（每日生理鹽水灌胃）。3周后處死小鼠。

心肌羥脯氨酸測定：羥脯氨酸試劑盒購自南京建成生物工程研究所。按試劑盒說明操作，測定左心室心肌組織中羥脯氨酸含量。間質(zhì)膠原平均包含13.4% 羥脯氨酸，間質(zhì)膠原含量等于羥脯氨酸的含量乘以7.46[3]，結(jié)果以μg /mg 表示每毫克心臟組織中膠原的含量[4]。

心肌膠原形態(tài)學觀察及定量分析：石蠟包埋，切片厚約4 μm，用Van-Gieson（VG）染色法，光鏡下可見心肌細胞呈黃色，膠原呈紅色。然后用Image-Pro 6.0圖像分析軟件進行圖像分析，測量左心室的膠原容積分數(shù)（CVF），CVF=左心室膠原面積/所測視野面積。隨機取6個視野，以均值作為該心臟的CVF。

免疫組織化學法測定心肌IL-1、IL-6和TNF-α表達情況：石蠟切片，常規(guī)脫蠟，3 ml/L過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，熱修復抗原后，滴加一抗IL-1（1:200 稀釋，購自博士德公司）、IL-6 （1:100 稀釋，購自奧博森公司）、TNF-α（1:200 稀釋，購自博士德公司），4℃過夜；滴加生物素標記的二抗，37℃孵育30 min；加辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液；二氨基苯聯(lián)胺（DAB）顯色，封片。應用Image-Pro 6.0圖像分析軟件對IL-1、IL-6、TNF-α（細胞質(zhì)中棕褐色顆粒為陽性）蛋白表達進行圖像分析，每張切片取5 個連續(xù)的高倍視野，在陽性表達區(qū)隨機選擇5 個視野，通過image-Pro6.0分析測定平均陽性表達率，其值越高，表達量越多，進行半定量分析。

統(tǒng)計學處理：應用SPSS 17.0 軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。各組計量資料數(shù)據(jù)以表示。三組間比較在方差齊時用方差分析，兩兩比較用LSD。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

七組小鼠VG 染色以及膠原容積分數(shù)、羥脯氨酸和膠原含量結(jié)果（圖1、表1）：空白對照組及假手術(shù)組小鼠心臟組織可見少量纖維組織，TAC對照組、TAC+Praz組小鼠心肌細胞排列紊亂，心肌內(nèi)小血管周圍及心肌間質(zhì)有較多膠原沉積，左心室CVF較空白對照組明顯增高（P<0.01）；TAC+PE組、TAC+Prop組、TAC+Carv組心肌膠原沉積較TAC對照組減少，CVF 顯著降低（P<0.01），但仍高于空白對照組（P<0.01）；TAC+PE組心肌膠原沉積較TAC+Carv組減少，CVF降低（P<0.01），TAC+Prop組心肌膠原沉積較TAC+Carv組減少，CVF降低（P<0.05）。TAC對照組、TAC+Praz組小鼠心肌組織中羥脯氨酸和膠原含量較空白對照組顯著升高（P<0.01）；TAC+PE組、TAC+Prop組、TAC+Carv組小鼠心肌組織中羥脯氨酸和膠原含量較TAC對照組減少（P<0.01），但仍高于空白對照組（P<0.01），TAC+PE組小鼠心肌組織中羥脯氨酸和膠原含量較TAC+Carv組減少（P<0.01），TAC+Prop組小鼠心肌組織中羥脯氨酸和膠原含量較TAC+Carv組減少（P<0.05）。

七組小鼠心肌組織中IL-1、IL-6和TNF-α的表達情況（圖2、表2）：心肌組織中IL-1、IL-6和TNF-α在心肌細胞胞漿表達。TAC對照組、TAC+Praz組小鼠心肌組織中IL-1、IL-6和TNF-α表達較空白對照組顯著升高（P<0.01）；TAC+PE組、TAC+Prop組、TAC+Carv組小鼠心肌組織中IL-1、IL-6和TNF-α表達較TAC對照組減少（P<0.01），但仍高于空白對照組（P<0.01），TAC+PE組小鼠心肌組織中IL-1、IL-6和TNF-α表達較TAC+Carv組減少（P<0.01），TAC+Prop組小鼠心肌組織中IL-1、IL-6和TNF-α較TAC+Carv組減少（P<0.05）。

圖1　七組小鼠Van-Gieson染色膠原形態(tài)學觀察（×100）

表1　七組小鼠膠原容積分數(shù)及羥脯氨酸和膠原含量比較（n=7，±s）

表2　七組小鼠心肌組織中白細胞介素-1、白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α的含量（IOD）比較（n=7，±s）

表2　七組小鼠心肌組織中白細胞介素-1、白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α的含量（IOD）比較（n=7，±s）

注：IOD：光密度，通過Image-Pro 6.0軟件測定定量分析所得，反映蛋白單位面積濃度，與蛋白定量呈對數(shù)關(guān)系。與空白對照組相比*P<0.01；與腹主動脈縮窄對照組相比△P<0.01；與腹主動脈縮窄+卡維地洛組相比▲P<0.01▲▲P<0.05

組別　白細胞介素-1(D/μm2)　白細胞介素-6(D/μm2)　腫瘤壞死因子-α(D/μm2))空白對照組　2.16±0.14△▲　3.71±0.53△▲2.45±0.26△▲假手術(shù)組　2.61±0.65△▲　4.22±0.41△▲　2.70±0.34△▲腹主動脈縮窄對照組　43.56±1.76*▲　46.75±0.76*▲　43.49±2.14*▲腹主動脈縮窄+苯腎上腺素組　5.34±0.30*△▲　8.59±0.32*△▲　6.57±0.58*△▲腹主動脈縮窄+哌唑嗪組　42.54±1.98*▲　47.00±1.28*▲　42.78±2.35*▲腹主動脈縮窄+普萘洛爾組　18.97±0.82*△▲▲　20.22±1.51*△▲▲　19.50±1.99*△▲▲腹主動脈縮窄+卡維地洛組　21.39±1.47*△　21.85±0.29*△　22.19±1.01*△

圖2　免疫組織化學法檢測七組小鼠白細胞介素-1、白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α表達情況

3　討論

心肌纖維化是多種心血管病不斷進展最終導致心臟功能衰竭的一個重要病理改變，是心肌重構(gòu)的關(guān)鍵病理特征和重要形成原因。其主要表現(xiàn)為心肌組織中膠原纖維過度沉積，膠原含量顯著增加，各型膠原比例失調(diào)且排列紊亂。目前認為，心肌纖維化過程中的靶細胞主要是成纖維細胞，研究比較明確的刺激因素有：腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、細胞因子以及壓力超負荷等。最終影響心肌細胞外基質(zhì)（ECM）沉積的表達產(chǎn)物或使ECM過度增生，或使ECM降解異常，主要與基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）及其組織抑制因子（TIMP）的平衡失調(diào)有關(guān)[5]，而成纖維細胞的增殖異常則受某些細胞周期因子的調(diào)控。IL-1、IL-6和TNF-α被認為是心肌纖維化過程中的胞外刺激因素，它們可以對上述某些環(huán)節(jié)產(chǎn)生影響。

交感神經(jīng)系統(tǒng)作為多種心臟病理生理狀態(tài)的重要刺激因素之一，已被很多研究所證實。臨床和動物遺傳學研究均顯示，α1-AR在心肌細胞生長發(fā)育和病理肥厚中有著重要的作用[6]，但對于α受體阻滯劑對心肌纖維化的作用研究較少。

本研究采用TAC法建立壓力超負荷小鼠模型，TAC組小鼠心肌組織中總膠原（VG染色）及羥脯氨酸含量明顯增多，證實壓力超負荷導致小鼠心肌纖維化的發(fā)生，IL-1、IL-6和TNF-α表達也較空白對照組明顯升高，這與有關(guān)研究報道[7-9]相同。給予PE、Prop、Carv對心肌纖維化小鼠進行干預后，這三組小鼠的CVF、羥脯氨酸含量均較TAC對照組明顯降低，但仍高于空白對照組，表明PE、Prop、Carv均可部分緩解壓力超負荷誘導的心肌纖維化；TAC+PE組、TAC+Prop組小鼠的CVF、羥脯氨酸含量與TAC+Carv組相比明顯降低，表明PE、Prop對壓力超負荷誘導心肌纖維化的緩解作用優(yōu)于Carv；給予Praz對心肌纖維化小鼠進行干預后，CVF、羥脯氨酸含量均較TAC對照組無明顯降低，表明Praz對壓力超負荷誘導的心肌纖維化無明顯影響；提示激活α1-AR或抑制β-AR可部分緩解壓力超負荷誘導的心肌纖維化，且抑制β-AR的同時抑制α1-AR會部分降低β-AR對壓力超負荷誘導的心肌纖維化的緩解作用。TAC+PE組小鼠IL-1、IL-6 和TNF-α表達較TAC+Prop組和TAC+Carv組明顯降低，TAC+Prop組小鼠IL-1、IL-6和TNF-α表達較TAC+Carv組降低，表明PE緩解壓力超負荷誘導的心肌纖維化的同時伴隨著IL-1、IL-6和TNF-α表達的降低；雖然TAC+PE組與TAC+Prop組小鼠心肌纖維化程度無顯著差異，但TAC+PE組小鼠IL-1、IL-6和TNF-α表達明顯低于TAC+Prop組，提示PE與Prop緩解壓力超負荷誘導的心肌纖維化的機制可能不同，且PE緩解壓力超負荷誘導的心肌纖維化可能影響IL-1、IL-6和TNF-α的表達。

在正常心臟的所有受體中，β-AR大約占90%，而α1-AR約占10%。β-AR抑制對心力衰竭有明顯的益處，但有臨床研究結(jié)果表明，在心力衰竭患者中過多降低去甲腎上腺素水平是有害的[10]。有研究提示，心力衰竭時α1-AR數(shù)量并沒有下調(diào)，而是相應提高，通過激活生理性肥厚、阻止細胞死亡和增加正性肌力反應保護心臟，預防病理性心室重構(gòu)[11]，使得我們不得不重新審視α1-AR的功能。

本研究證實，PE可以有效減輕壓力超負荷誘導小鼠的心肌纖維化，因此我們推測，早期使用α1受體激動劑可能會改善心肌纖維化程度，減緩心室重構(gòu)發(fā)生、發(fā)展的病理進程。本研究還觀察到PE對心肌纖維化的調(diào)節(jié)伴隨IL-1、IL-6和TNF-α表達的降低，但具體機制尚不清楚，需進一步證實及探討。

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（編輯：朱柳媛）

收稿日期：（2015-08-30）

中圖分類號：R54

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3614（2016）03-0289-05

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.03.020

作者簡介：王碩 碩士研究生 研究方向為心血管疾病基礎(chǔ)與臨床 Email：ddd456852@ 126.com 通訊作者：龐曉 Email：px0993@163.com

目的：明確α1腎上腺素能受體（α1-AR）激動劑苯腎上腺素（PE）在壓力超負荷誘導心肌纖維化過程中的作用，觀察該過程中炎癥因子白細胞介素-1（IL-1)、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的變化。

方法：昆明（KM）小鼠49只，隨機分成空白對照組、腹主動脈結(jié)扎（TAC）組和假手術(shù)組，8周后再將TAC組小鼠隨機分為5組，包括TAC對照組、TAC+PE組、TAC+哌唑嗪（Praz）組、TAC+普萘洛爾（Prop）組和TAC+卡維地洛（Carv）組，分別給予不同的藥物處理3周后，測定小鼠左心室組織膠原容積積分（CVF）、羥脯氨酸含量以及炎癥因子IL-1、IL-6 和TNF-α的表達變化。

結(jié)果：TAC 8周后，小鼠出現(xiàn)明顯心肌纖維化，左心室組織CVF、羥脯氨酸含量以及IL-1、IL-6和TNF-α的表達均較空白對照組顯著增高（P<0.01）；與TAC組相比，TAC+PE組、TAC+ Prop組和TAC+Carve組的左心室CVF、羥脯氨酸含量及IL-1、IL-6、TNF-α的蛋白表達均明顯降低（P<0.01），而TAC+Praz組的左心室CVF、羥脯氨酸含量及IL-1、IL-6、TNF-α表達變化不明顯（P>0.05）；與TAC+PE組相比，TAC+Prop組左心室CVF、羥脯氨酸含量差異無統(tǒng)計學意義，但IL-1、IL-6和TNF-α的蛋白表達顯著降低（P<0.05）。

結(jié)論：PE通過激活α1-AR，可改善壓力超負荷誘導的心肌纖維化和炎癥因子IL-1、IL-6及TNF-α的表達，α1-AR可能是心肌纖維化的防御因素。