王亞麗，吳 峰*，牟曉燕，胡 鋒，陶玉堅(jiān)，黃玉民，胡 濤，邵向榮

(1揚(yáng)州市第一人民醫(yī)院呼吸科，揚(yáng)州 225002；2山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院呼吸科，濟(jì)南 250021)

肺腺癌起病隱匿，進(jìn)展迅速，病死率高，化療療效欠佳，且不良反應(yīng)嚴(yán)重[1]，分子靶向治療是目前肺癌研究的熱點(diǎn)，取得了迅速的進(jìn)展。分子靶向治療的靶點(diǎn)是指具有重要生理或病理功能，能夠與藥物相結(jié)合并產(chǎn)生藥理作用的生物大分子及其特定的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)。其中，針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)和環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase, COX-2)的靶向治療是臨床研究較為成熟的類型。

越來(lái)越多證據(jù)表明[2]，EGFR和COX-2信號(hào)途徑共同導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展?；罨疎GFR信號(hào)途徑或增強(qiáng)COX-2來(lái)源的前列腺素表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。COX-2可誘導(dǎo)花生四烯酸合成前列腺素，是預(yù)防和治療癌癥的靶點(diǎn)之一，在許多惡性病變中過(guò)表達(dá)，參與惡性腫瘤的增殖和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，選擇性COX-2 抑制劑塞來(lái)昔布(celecoxib)對(duì)多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展都有明顯的抑制作用[3]。而EGFR是一個(gè)跨膜糖蛋白，具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性，與配體結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)，其在肺腺癌中過(guò)度表達(dá)，并與肺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[4]。臨床應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌靶向治療的表皮生長(zhǎng)因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKI)主要有吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)，是目前最有前途的特異性腫瘤靶向治療分子之一，適用于化療失敗或不能耐受的非小細(xì)胞肺癌患者[5,6]。但單藥療效有限，部分患者對(duì)單藥存在原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥。

肺癌的發(fā)生、發(fā)展涉及多個(gè)發(fā)病環(huán)節(jié)，治療的靶點(diǎn)可以是生長(zhǎng)因子受體、癌基因和抑癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)鍵分子和途徑、血管形成關(guān)鍵分子和途徑、耐藥基因及其產(chǎn)物等。肺癌的治療需要同時(shí)調(diào)控多個(gè)分子靶點(diǎn)。在肺癌治療中同時(shí)針對(duì)兩個(gè)不同的靶點(diǎn)治療是一種有效的縮小腫瘤、阻斷侵襲、預(yù)防遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的手段。目前國(guó)外在頭頸部腫瘤等研究中[7,8]顯示EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路能增強(qiáng)有絲分裂原激活的蛋白激酶活化，導(dǎo)致激活蛋白-1介導(dǎo)的COX-2的轉(zhuǎn)錄和前列腺素E2的合成增強(qiáng)，而COX-2衍生的前列腺素E2可以刺激EGFR信號(hào)的傳導(dǎo)。因此，EGFR和COX-2信號(hào)途徑協(xié)同作用、交叉對(duì)話，共同促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，包括細(xì)胞增殖、凋亡，血管生成和侵襲。本文研究雙靶點(diǎn)阻滯EGFR和COX-2信號(hào)途徑對(duì)肺腺癌細(xì)胞的抑制作用，并探討聯(lián)合作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料及分組

兔抗人EGFR多克隆抗體和兔抗人COX-2多克隆抗體(武漢博士德公司產(chǎn)品)，4℃保存?zhèn)溆谩５鞍滋崛≡噭┖小⒌鞍诐舛葴y(cè)定試劑盒(上海申能博彩公司)。人肺腺癌細(xì)胞株A549由山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。實(shí)驗(yàn)用藥物在無(wú)菌狀態(tài)下研磨，用適量二甲基亞砜(DMSO)配成母液，所有實(shí)驗(yàn)中的DMSO終濃度均<0.1%[9]。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)階段通過(guò)MTT研究發(fā)現(xiàn)，吉非替尼(5 μmol/L)聯(lián)合塞來(lái)昔布(25 μmol/L)組抑制率較高，且細(xì)胞大片死亡率少，更有利于研究凋亡、細(xì)胞周期以及靶蛋白的表達(dá)；增加聯(lián)合藥物劑量，聯(lián)合用藥組細(xì)胞大片死亡。根據(jù)Chen等[10]研究結(jié)果，故聯(lián)合用藥組劑量分別選用吉非替尼5 μmol/L和塞來(lái)昔布25 μmol/L。本研究分為4組，A組：正常對(duì)照組；B組：?jiǎn)嗡幖翘婺?5 μmol/L)；C組：?jiǎn)嗡幦麃?lái)昔布(25 μmol/L)；D組：吉非替尼(5 μmol/L)+塞來(lái)昔布(25 μmol/L)聯(lián)合用藥組，均以RPMI 1640培養(yǎng)液配置濃度。

1.2 Hoechst33258染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

貼壁A549細(xì)胞以5×105/ml密度接種于含玻片的12孔培養(yǎng)板，設(shè)正常對(duì)照組、吉非替尼組、塞來(lái)昔布組、聯(lián)合用藥組。37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，實(shí)驗(yàn)藥物干預(yù)后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗2遍，每次3 min，加入10 mg/L Hoechst 33258的染液，37℃孵育30 min，熒光顯微鏡觀察、照像。同一處理方法隨機(jī)選擇至少10個(gè)觀察視野，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。通過(guò)金正均法計(jì)算聯(lián)合用藥在促進(jìn)細(xì)胞凋亡方面是否具有協(xié)同作用。q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb),Ea+b為聯(lián)合處理組細(xì)胞凋亡率，Ea、Eb分別為應(yīng)用a藥和b藥單純處理的細(xì)胞凋亡率。q值在0.85～1.15間時(shí)為兩藥單純相加，q>1.15為兩藥合用有協(xié)同作用，q<0.85為兩藥合用有拮抗作用。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞培養(yǎng)24 h，設(shè)正常對(duì)照組、吉非替尼組、塞來(lái)昔布組、聯(lián)合用藥組。藥物干預(yù)48 h，收集細(xì)胞，制成1×106/ml的單細(xì)胞懸液，冷PBS洗滌2次，制成單細(xì)胞懸液，快速加入預(yù)冷的70%乙醇，4℃固定，1000 轉(zhuǎn)/min離心5 min，棄上清液，RNA消化30 min，加1 ml碘化丙啶(0.05 g/L)調(diào)整細(xì)胞密度為l×106/L，4℃避光染色30 min，上樣。流式細(xì)胞儀檢測(cè)(激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm)、實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用Multicycle for windows軟件分析細(xì)胞周期分布的變化。計(jì)算出各周期細(xì)胞的百分率。

1.4 臺(tái)盼藍(lán)(Trypan Blue)染色法檢測(cè)細(xì)胞抑制率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，每孔100 μl接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，分別加入不同終濃度的吉非替尼(0.5，1，10，25，50，100，150 μmol/L)、塞來(lái)昔布(15，20，25，50，100，150，200 μmol/L)、吉非替尼(5 μmol/L)+塞來(lái)昔布(25 μmol/L)、RPMI 1640全培養(yǎng)液的空白對(duì)照, 另設(shè)溶劑DMSO對(duì)照組，每組設(shè)置5個(gè)平行復(fù)孔。置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24，48和72 h后，胰酶消化貼壁細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，并作適當(dāng)稀釋，臺(tái)盼藍(lán)(Trypan Blue)法染色。在3 min內(nèi)，分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。鏡下觀察，死細(xì)胞被染成明顯的藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染呈無(wú)色透明狀。統(tǒng)計(jì)細(xì)胞活力：活細(xì)胞率(%)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%

1.5 Western blot檢測(cè)EGFR和COX-2蛋白的表達(dá)

細(xì)胞培養(yǎng)及處理方法同上，收集1×106個(gè)細(xì)胞，PBS洗2次，超聲裂解細(xì)胞液于EP管，用BCA法，紫外分光光度計(jì)在562nm處檢測(cè)吸光度值，用標(biāo)準(zhǔn)蛋白擬合曲線，計(jì)算蛋白濃度，確定上樣量。提取蛋白并上樣后進(jìn)行15%SDS-PAGE電泳分離，然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。放入培養(yǎng)皿中，用含5%脫脂奶粉TBST封閉1 h后，洗膜后加入1︰100兔抗人EGFR的多克隆抗體4℃過(guò)夜。再次洗膜，用辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)羊抗兔Ig G 孵育1 h，充分洗膜后進(jìn)行顯色、曝光、顯影、定影。應(yīng)用LAS-4000凝膠成像顯影(FUJI Gauge Ver.3.0凝膠圖像分析系統(tǒng))，以電泳圖中各目的條帶分別與β-actin條帶的光密度比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。相對(duì)系數(shù)=目的條帶表達(dá)強(qiáng)度/β-actin表達(dá)強(qiáng)度，以此進(jìn)行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)；多組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 雙靶點(diǎn)阻滯對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst33258是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染色劑。熒光顯微鏡下，活細(xì)胞核呈彌散均勻熒光，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)濃染致密的顆粒狀熒光,并可見(jiàn)凋亡小體。與正常對(duì)照組相比，吉非替尼、塞來(lái)昔布單藥均可引起A549細(xì)胞凋亡(P<0.05)，48 h后聯(lián)合用藥組凋亡率高達(dá)32.40%，與吉非替尼組(7.12%)和塞來(lái)昔布組(8.43%)相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01；圖1)。通過(guò)金正均法計(jì)算得q=1.89，說(shuō)明吉非替尼與塞來(lái)昔布聯(lián)用具有協(xié)同促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡作用。

2.2 雙靶點(diǎn)阻滯對(duì)細(xì)胞周期的影響

單藥吉非替尼和塞來(lái)昔布組S%分別為(37.4±1.6)%和(21.0±3.1)%，G0/G1%分別為(61.4±5.2)%和(51.8±4.7)%，提示吉非替尼、塞來(lái)昔布均引起G0～G1期阻滯。與單藥組相比，聯(lián)合用藥組S期細(xì)胞比例明顯減少(P<0.01)，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加(P<0.01)，由此可見(jiàn)聯(lián)合用藥G0～G1期阻滯作用增強(qiáng)(表1)。

2.3 雙靶點(diǎn)阻滯對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用

臺(tái)盼藍(lán)是細(xì)胞活性染料，活細(xì)胞不會(huì)被染成藍(lán)色，而死細(xì)胞會(huì)被染成淡藍(lán)色。檢測(cè)結(jié)果顯示，藥物作用48 h后，單藥吉非替尼和塞來(lái)昔布對(duì)細(xì)胞的抑制作用具有劑量依賴性，同種藥物各劑量間細(xì)胞抑制率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，在濃度 1～150 μmol/L間，相同劑量吉非替尼和塞來(lái)昔布作用48 h后細(xì)胞抑制率之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；圖2)。5 μmol/L吉非替尼和25 μmol/L塞來(lái)昔布單獨(dú)或聯(lián)合作用不同時(shí)間，相同劑量同種藥物不同作用時(shí)間組細(xì)胞抑制率差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01；圖3)，但聯(lián)合用藥組24 h和48 h組間無(wú)明顯差異(P>0.05)。加藥48 h，單藥吉非替尼(5 μmol/L)和塞來(lái)昔布(25 μmol/L)細(xì)胞抑制率分別為(24.8±2.1)%和(21.5±1.7)%，吉非替尼(5 μmol/L)聯(lián)合塞來(lái)昔布(25 μmol/L)組抑制率為(58.2±4.6)%，明顯高于單藥組(P<0.01；圖3)。

圖1 Hoechst33258染色法檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡率

Group G0/G1SG2Control11.2±2.258.9±5.229.9±2.9Gefitinib(5μmol/L)61.4±5.2**##37.4±1.6**##1.2±0.3**#Celecoxib(25μmol/L)51.8±4.7**##21.0±3.1**##27.2±2.4#Gefitinib(5μmol/L)+Celecoxib(25μmol/L)87.2±6.4**3.2±0.9**9.6±1.4*

Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01; compared with gefitinib (5 μmol/L)+celecoxib (25 μmol/L) group,#P<0.05,##P<0.01

圖2 不同劑量藥物作用48 h后細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線

圖3 5 μmol/L吉非替尼和25 μmol/L塞來(lái)昔布單獨(dú)

2.4 Western blot檢測(cè)聯(lián)合作用對(duì)EGFR和COX-2蛋白的影響

藥物處理后將各組細(xì)胞裂解并進(jìn)行免疫印跡測(cè)定蛋白表達(dá)情況(圖4)，用FUJI Gauge Ver．3.0凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。在正常A549細(xì)胞中兩者EGFR和COX-2均高表達(dá)。聯(lián)合用藥D組(5 μmol/L吉非替尼 +25 μmol/L塞來(lái)昔布)EGFR和COX-2的表達(dá)明顯降低，與B組(5 μmol/L吉非替尼)和C組(25 μmol/L塞來(lái)昔布)相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；圖4)。

圖4 Western blot檢測(cè)吉非替尼和塞來(lái)昔布單獨(dú)或

3 討 論

肺腺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，除傳統(tǒng)手術(shù)和放、化療外，針對(duì)EGFR的靶向藥物是目前全球研究熱點(diǎn)之一，在發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤活性的同時(shí)，減少對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用，在臨床實(shí)踐中取得了顯著的療效[11-13]。吉非替尼是靶向EGFR的成熟的抗腫瘤藥物，國(guó)內(nèi)外研究表明，吉非替尼治療晚期非小細(xì)胞肺癌的腫瘤緩解率 9%～37%，癥狀緩解率 35%～42%[14,15]。而美國(guó)Emory大學(xué)研究顯示，另一個(gè)臨床抗腫瘤藥物環(huán)氧合酶2抑制劑塞來(lái)昔布，可能通過(guò)激活外源性死亡受體通路誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡。

肺癌的增殖與轉(zhuǎn)移是多基因共同參與、協(xié)同作用的結(jié)果，單一阻斷一個(gè)信號(hào)通路不能完全阻滯肺癌的發(fā)生、發(fā)展，且常常因腫瘤耐藥而使靶向作用消失。雙靶點(diǎn)阻滯可通過(guò)干擾多個(gè)信號(hào)激酶的活性而發(fā)揮協(xié)同作用抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，從而提高藥物療效。因此，多靶點(diǎn)治療的療效明顯優(yōu)于單靶點(diǎn)藥物的治療效果。2016年Reckamp等[16]研究顯示，厄洛替尼聯(lián)合塞來(lái)昔布組較單獨(dú)用藥組能顯著延長(zhǎng)EGFR野生型肺腺癌患者無(wú)進(jìn)展生存期(3.2vs1.8 個(gè)月，P=0.03)，在 EGFR 野生型人群中的有效性得到顯著改善，需要進(jìn)一步的研究來(lái)探討具有 COX-2 依賴性的EGFR-TKI 療法的機(jī)制。目前國(guó)內(nèi)外研究多選用EGFR高突變型細(xì)胞株HCC827，對(duì)EGFR野生型細(xì)胞株研究相對(duì)較少，因此本研究通過(guò)探討雙靶點(diǎn)阻滯EGFR和COX-2信號(hào)途徑對(duì)肺腺癌EGFR野生型A549細(xì)胞的殺傷和促凋亡作用，旨在為EGFR抑制劑與環(huán)氧合酶-2抑制劑聯(lián)合應(yīng)用于肺癌治療提供一些新思路與新方法。

盡管EGFR和COX-2在肺腺癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)，但是越來(lái)越多證據(jù)表明EGFR和COX-2兩種信號(hào)途徑相互促進(jìn)、共同激活，EGFR和COX-2的協(xié)同高表達(dá)往往預(yù)示著腫瘤的不良預(yù)后和高復(fù)發(fā)[17]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示肺腺癌細(xì)胞中有環(huán)氧合酶-2和表皮生長(zhǎng)因子受體協(xié)同高表達(dá)，EGFR和COX-2信號(hào)通路共同參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增生，作用48h后吉非替尼和塞來(lái)昔布對(duì)肺腺癌細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，且呈劑量依賴性，兩者聯(lián)用抑制作用明顯高于單藥組。同時(shí)，我們通過(guò)Hoechst33258染色法和流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，雙靶點(diǎn)阻斷EGFR和COX-2信號(hào)途徑能協(xié)同抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖，主要機(jī)制為協(xié)同誘導(dǎo)凋亡和共同的G0/G1周期阻滯。各種抗凋亡基因和促凋亡基因的表達(dá)異常是各種腫瘤發(fā)生的重要原因。許多抗腫瘤藥物對(duì)細(xì)胞周期有特異的阻斷作用，并可誘發(fā)細(xì)胞凋亡，而凋亡也常伴有生長(zhǎng)抑制。

國(guó)外最新研究表明[1,2,10,18]，前列腺素E2通過(guò)誘導(dǎo)EGFR和ERK磷酸化共同活化EGFR和COX-2。另外，在直腸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)COX-2的高表達(dá)通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)途徑的激活誘導(dǎo)EGFR的表達(dá)，而 EGFR配體轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α可以通過(guò)MAPK途徑誘導(dǎo)COX-2表達(dá)。因此，針對(duì) EGFR和COX-2雙靶點(diǎn)治療，可以協(xié)同阻滯EGFR和COX-2雙信號(hào)途徑及其下游靶分子。EGFR和COX-2信號(hào)通路協(xié)同參與調(diào)控腫瘤基因轉(zhuǎn)錄，腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡抑制以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等。本試驗(yàn)采用Western blot研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥組EGFR和COX-2蛋白的表達(dá)與單藥組相比均明顯降低。提示兩藥聯(lián)用同時(shí)增強(qiáng)了對(duì)兩個(gè)信號(hào)途徑的抑制作用。Zhang等[18]在頭頸部腫瘤裸鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合阻斷EGFR和COX-2信號(hào)途徑能明顯抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，具體機(jī)制如下：下調(diào)磷酸化的EGFR，降低前列腺素E生成，下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和ki67表達(dá)，而在小干擾RNA介導(dǎo)的EGFR和COX-2雙重基因的沉默中進(jìn)一步證實(shí)雙靶點(diǎn)阻滯的協(xié)同作用。因此，EGFR和COX-2信號(hào)途徑交叉對(duì)話，在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及上皮間質(zhì)化等途徑中具有重要意義。聯(lián)合阻滯 EGFR和COX-2信號(hào)途徑對(duì)肺癌A549細(xì)胞具有協(xié)同抑制作用，這為肺腺癌的預(yù)防和治療提供了新思路和新策略，但是這種協(xié)同作用需要進(jìn)一步的體內(nèi)試驗(yàn)和臨床研究證實(shí)。

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