郭佳南　劉文鈺　周東　田林郁

(四川大學(xué)華西醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 成都　610041)

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盲腸結(jié)扎穿孔敗血癥小鼠模型的手術(shù)方式優(yōu)化*

郭佳南劉文鈺周東田林郁△

(四川大學(xué)華西醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 成都610041)

摘要目的：探究如何對(duì)傳統(tǒng)盲腸穿孔結(jié)扎(Cecal ligation-and-perforation，CLP)敗血癥模型手術(shù)方式進(jìn)行優(yōu)化。方法：選取雄性昆明小鼠103只按是否給予亞胺培南/西司他丁分為：抗生素組、無抗生素組和假手術(shù)組。在傳統(tǒng)CLP手術(shù)方式的基礎(chǔ)上縮小手術(shù)切口，調(diào)整切口位置和術(shù)后抗生素用量來觀察接受手術(shù)小鼠術(shù)后存活率及不同批次間小鼠存活率一致性等指標(biāo)，并與既往文獻(xiàn)報(bào)道的同類模型進(jìn)行比較。結(jié)果：在本次實(shí)驗(yàn)103只小鼠手術(shù)中，抗生素組、無抗生素組和假手術(shù)組三組小鼠存活時(shí)間的分布總體有差異(P=0.026)。組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)：抗生素組與無抗生素組7天生存率明顯高于無抗生素組(P<0.001)，假手術(shù)組生存率明顯高于無抗生素組生存率(P<0.001)，而抗生素組與假手術(shù)組存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.331)?？股亟M10個(gè)批次小鼠存活率的Cronbach’s α系數(shù)為0.954。結(jié)論：優(yōu)化后的CLP小鼠模型存活率與傳統(tǒng)模型相似，具更亦操作的標(biāo)準(zhǔn)化的手術(shù)流程，切口更小，組間生存率一致性高，可重復(fù)性好。

關(guān)鍵詞：敗血癥；動(dòng)物模型；手術(shù)方式；盲腸結(jié)扎穿孔；生存率

敗血癥是ICU患者高發(fā)的疾病，也是ICU患者常見的死因。在中國大陸的一項(xiàng)多中心的隊(duì)列研究顯示，ICU患者被診斷重度敗血癥或感染性休克的比例為37.3%，在ICU住院期間死亡率高達(dá)28.7%[1]，而在世界范圍內(nèi)的敗血癥總死亡率在30%到70%不等，平均死亡率約在50%[2]。而因創(chuàng)傷入院的患者中有近一半的患者合并敗血癥[3]。即使救治及時(shí)使患者度過危險(xiǎn)期，仍然有許多遠(yuǎn)期并發(fā)癥，如免疫抑制狀態(tài)和肺部損傷[3]等。另外，敗血癥也是很多發(fā)展中國家的兒童的主要死亡原因之一[4]。因此，對(duì)敗血癥的基礎(chǔ)研究至關(guān)重要。

盲腸結(jié)扎穿孔動(dòng)物模型(Cecal ligation and puncture，CLP)被認(rèn)為是目前多種敗血癥動(dòng)物模型的金標(biāo)準(zhǔn)。因?yàn)樗骗h(huán)了生物的自然屏障從而誘發(fā)敗血癥，因此可較準(zhǔn)確地從自然病程和病因上模擬人類的敗血癥[3]。另外，CLP敗血癥模型建立后的血流動(dòng)力學(xué)也與人類敗血癥的血流動(dòng)力學(xué)十分相似[5]。目前的CLP敗血癥動(dòng)物模型可在小鼠、大鼠等多種動(dòng)物上建立。本實(shí)驗(yàn)以小鼠為模型動(dòng)物對(duì)傳統(tǒng)CLP敗血癥小鼠的手術(shù)方式稍作優(yōu)化后觀察術(shù)后小鼠在不同時(shí)段的存活率并據(jù)此推測模型的穩(wěn)定性。

1材料與方法

1.1材料

選取103只體重為20-25 g清潔級(jí)昆明雄性小鼠(成都達(dá)碩生物有限公司提供)。飼養(yǎng)環(huán)境：10只/籠，24℃恒溫、恒濕飼養(yǎng)；采用12 h光-暗周期、飼料及飲水均經(jīng)紫外光照滅菌后供應(yīng)，術(shù)前及術(shù)后均充足供應(yīng)食物及水。為了更好擬合天然屏障被破壞后感染引起敗血癥的真實(shí)情況，小鼠術(shù)前不禁食；并據(jù)傳統(tǒng)CLP小鼠模型[5]的手術(shù)方法并進(jìn)行一定改造后手術(shù)，改造部分詳見表1。

1.2方法

1.2.1手術(shù)

手術(shù)分組：103只小鼠共分10批完成手術(shù)：第一至七批每批10只，第八至十批每批11只。每批次手術(shù)小鼠中，隨機(jī)選取1只作為假手術(shù)組，即麻醉后僅開腹后尋找盲腸后還納，關(guān)腹。剩余小鼠術(shù)后隨機(jī)分為抗生素組和無抗生素組2組。2組均接受CLP手術(shù)。本次實(shí)驗(yàn)共取103只小鼠手術(shù)，分10個(gè)批次手術(shù)，每批10或11只小鼠，全部手術(shù)均由相同的2名操作者協(xié)作完成，不同批次的手術(shù)均在手術(shù)當(dāng)天的同一時(shí)間段內(nèi)完成。其中抗生素組72只，無抗生素組22只，假手術(shù)組9只(最后1批次手術(shù)未設(shè)假手術(shù)組)。

表1　CLP動(dòng)物模型改造之處

1.2.2手術(shù)步驟

麻醉：用膠帶將小鼠四肢及尾部固定于無菌手術(shù)臺(tái)上，使用新鮮配置的3.5%水合氯醛溶液0.1 ml·10g-1體重進(jìn)行腹腔注射麻醉。為避免干擾手術(shù)，腹腔注射麻醉均選擇小鼠右下腹進(jìn)針。注射后約10 min用鑷子夾小鼠足趾，驗(yàn)證小鼠疼痛反應(yīng)下降滿意后開始手術(shù)。

開腹：備皮后使用5%聚維酮碘溶液消毒整個(gè)腹部皮膚，用剪刀在劍突下中線偏左3-5 mm開已平行于中線的長約0.5-1.0 cm縱行切口，逐層剪開至打開腹膜暴露腸管。

結(jié)扎：用小號(hào)平鑷輕輕提起盲腸，找到盲腸游離末端輕提使之與其余腸管分離。用4-0絲線在距盲腸末端約1 cm處結(jié)扎盲腸，注意避免結(jié)扎或損傷腸系膜血管。

穿孔：使用22G針頭在被結(jié)扎的盲腸中點(diǎn)處穿孔，針頭需穿通全層腸壁并由另一側(cè)穿出。使用平鑷輕夾腸管至擠壓出少量腸內(nèi)容物，約與穿刺針孔大小相當(dāng)，后還納腸管至腹腔。消毒局部切口切緣后使用4-0絲線逐層關(guān)腹。

關(guān)腹后再次使用5%聚維酮碘溶液消毒切口處，并以右下腹為進(jìn)針點(diǎn)腹腔注射0.5ml無菌生理鹽水補(bǔ)液，見圖1。

將術(shù)后小鼠放回已滅菌的鼠籠，并隨機(jī)分為2組：抗生素組和無抗生素組。抗生素組術(shù)后3 h后給第一劑抗生素，抗生素采用亞胺培南/西司他丁(Imipenem/cilastatin，Tienam; Merck Sharp & Dohme Ltda)333.33 mg·kg-1。無抗生素組同時(shí)接受等量無菌生理鹽水腹腔注射。以后每12 h按組別給抗生素或生理鹽水一次，至小鼠死亡或給藥滿3天。假手術(shù)組小鼠術(shù)后立即腹腔注射一劑亞胺培南/西司他丁，333.33 mg·kg-1預(yù)防切口感染。隨后3天與無抗生素組小鼠同等處理。

1.2.3觀察指標(biāo)

觀察各組小鼠術(shù)后的活動(dòng)、進(jìn)食進(jìn)水狀況、切口生長情況，記錄小鼠術(shù)后24 h至術(shù)后7 d每天的存活率。

圖1　手術(shù)方法示意圖A手術(shù)切口；B找到盲腸后據(jù)盲端約1 cm處結(jié)扎；C用平鑷輕擠出少量腸內(nèi)容物；D將盲腸還納腹腔，逐層關(guān)腹

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用壽命表法(Life-table method)進(jìn)行生存分析，使用Wilcoxon法來對(duì)三組小鼠的生存時(shí)間的分布進(jìn)行整體比較。繪制生存曲線并對(duì)接受標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)及抗生素治療的不同批次的小鼠生存率采用Cronbach’s α系數(shù)法進(jìn)行信度評(píng)價(jià)。P<0.05被認(rèn)為是結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Cronbach’s α系數(shù)>0.7被認(rèn)為信度較高。

2結(jié)果

在完成手術(shù)后觀察并記錄術(shù)后24 h、48 h、72 h、及術(shù)后7 d小鼠的切口情況、活動(dòng)狀況及存活率。

本次實(shí)驗(yàn)接受手術(shù)的小鼠在術(shù)后麻醉蘇醒后活動(dòng)較多，僅較術(shù)前稍減少。但術(shù)后第6-24 h明顯有進(jìn)食、飲水及活動(dòng)的減少。切口在1 cm內(nèi)，在術(shù)后7 d的觀察期內(nèi)包括無抗生素組小鼠的所有觀察對(duì)象在死亡前或觀察期結(jié)束前均不合并局部切口感染。

截止隨訪的時(shí)點(diǎn)，各組不同時(shí)間點(diǎn)的存活率詳見表2。

表2　各組不同時(shí)間點(diǎn)的存活率(%)

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.001。

使用采用壽命表法(Life-table method)進(jìn)行生存分析后生存曲線如圖2，使用wilcoxon法來對(duì)三組小鼠的生存時(shí)間的分布進(jìn)行整體比較后發(fā)現(xiàn)，三組小鼠存活時(shí)間的分布總體有差異(P=0.026)。經(jīng)組間兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，抗生素組生存率高于無抗生素組(P<0.001)，假手術(shù)組生存率高于無抗生素組生存率(P<0.001)，而抗生素組與假手術(shù)組存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.331)。

在第一、二批接受手術(shù)的21只小鼠中，觀察至術(shù)后第8周。至術(shù)后第8周，抗生素組存活10只，存活率為76.9%(10/13)，而無抗生素組存活率：12.5%(1/8)。8周后總存活率為52.3%(11/21)。

圖2　三組小鼠生存曲線

在10個(gè)批次接受標(biāo)準(zhǔn)化手術(shù)及抗生素治療的72只小鼠中，分別統(tǒng)計(jì)術(shù)后1-7天的存活率，得到Cronbach’s α系數(shù)為0.954。

3討論

敗血癥是ICU中發(fā)病率高，死亡率高的疾病。當(dāng)下醫(yī)學(xué)對(duì)敗血癥的治療仍然與三十年前的治療方式相同[7]。因此，雖然敗血癥是一種古老的疾病，但對(duì)它的發(fā)病機(jī)理與治療的研究卻并不過時(shí)。目前仍有多種敗血癥動(dòng)物模型用于敗血癥的基礎(chǔ)研究，包括三種機(jī)制：1、外源性毒素入血，如：內(nèi)毒素模型(Endotoxin model)；2、外源性病原體入血，如：活菌模型(Live bacteria model)；3、天然屏障破壞，如盲腸結(jié)扎穿孔模型(Cecal ligation-and-perforation model)等[7]。

良好的敗血癥小鼠模型應(yīng)具備以下特性：標(biāo)準(zhǔn)化(Standardization),可重復(fù)性(Reproducibility), 以及多用途(Versatility)等特性[8]。盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)模型因其發(fā)病機(jī)制與人類敗血癥的自然發(fā)病機(jī)制相似而被認(rèn)為是各類敗血癥動(dòng)物模型中的“金標(biāo)準(zhǔn)”。CLP之所以被廣泛應(yīng)用主要由于其多功能性：可以合并創(chuàng)傷、失血等因素進(jìn)行研究，亦可在其他疾病動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行建立。但因CLP手術(shù)方式難以標(biāo)準(zhǔn)化、死亡率受穿孔針大小影響較大而被認(rèn)為穩(wěn)定性較差。因此，基于現(xiàn)狀優(yōu)化CLP動(dòng)物模型的標(biāo)準(zhǔn)化流程及可重復(fù)性十分重要。本實(shí)驗(yàn)旨在探究如何優(yōu)化CLP敗血癥模型的手術(shù)方式及術(shù)后支持治療使模型具有更易標(biāo)準(zhǔn)化且可重復(fù)性好的建立流程。

3.1手術(shù)方式的標(biāo)準(zhǔn)化

本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)采取了傳統(tǒng)CLP手術(shù)步驟，對(duì)于針孔大小、穿孔數(shù)及穿孔位置這三項(xiàng)已被證實(shí)決定最終死亡率的指標(biāo)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化[9]。在Toscano M等人的報(bào)道中采用了22號(hào)針頭在據(jù)盲腸末端1 cm處結(jié)扎，并于結(jié)扎部位中點(diǎn)穿孔2次[5]。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)通過改變切口位置至劍突下中線偏左3-5 mm使手術(shù)視野更于對(duì)盲腸進(jìn)行操作，從而縮小了手術(shù)切口。本次實(shí)驗(yàn)接受手術(shù)的小鼠切口在1 cm內(nèi)，在術(shù)后7 d的觀察期內(nèi)包括無抗生素組小鼠的所有觀察對(duì)象在死亡前或觀察期結(jié)束前均不合并局部切口感染。

3.1.1手術(shù)切口的縮小

傳統(tǒng)小鼠的CLP手術(shù)往往采用1-2 cm[5,6]甚至超過2 cm的劍突下中線切口來完成手術(shù)，對(duì)于體重較小或月齡較小的小鼠是一個(gè)較大的打擊，而且切口大，術(shù)后局部切口感染的風(fēng)險(xiǎn)較高，不利于敗血癥小鼠的長期觀察。Katharina Sommer等人曾對(duì)CLP小鼠模型的切口愈合狀況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在敗血癥狀態(tài)下，傷口愈合能力下降，不僅使CLP手術(shù)術(shù)后傷口愈合時(shí)間延長，而且會(huì)影響遠(yuǎn)處傷口的愈合[10]。因此，在敗血癥的動(dòng)物模型中縮小手術(shù)切口可能會(huì)降低術(shù)后切口局部的感染風(fēng)險(xiǎn)，避免切口感染給動(dòng)物敗血癥的觀測帶來干擾。本次實(shí)驗(yàn)接受手術(shù)的小鼠切口在1 cm內(nèi)，在術(shù)后7 d的觀察期內(nèi)包括無抗生素組小鼠的所有觀察對(duì)象在死亡前或觀察期結(jié)束前均不合并局部切口感染。因此，適當(dāng)減小手術(shù)切口是必要的，尤其對(duì)于觀察期長，因免疫功能不全等因素而切口感染風(fēng)險(xiǎn)高的實(shí)驗(yàn)十分重要。

3.1.2抗生素的運(yùn)用

本實(shí)驗(yàn)選擇廣譜抗生素亞胺培南/西司他丁，并加大劑量進(jìn)行治療可以使發(fā)病后的實(shí)驗(yàn)小鼠長期存活，但并不會(huì)降低革蘭陰性菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素對(duì)機(jī)體的打擊，利于長期觀察和對(duì)重癥感染后遺的免疫功能抑制、認(rèn)知功能障礙等等疾病進(jìn)行探究。早在1997年，Wickel DJ等人通過對(duì)連續(xù)105例因腹膜炎繼發(fā)敗血癥的患者研究發(fā)現(xiàn)，臨床中因腹膜炎繼發(fā)敗血癥的患者死亡率直接與快速進(jìn)展的多器官衰竭相關(guān)，而非直接與腹膜炎的感染復(fù)發(fā)相關(guān)[11]。Gonnert FA等人研究發(fā)現(xiàn)，在腹膜炎繼發(fā)敗血癥的動(dòng)物模型中，雖然抗生素可以提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的存活率，但存活動(dòng)物的血清學(xué)炎癥反應(yīng)指標(biāo)及肝臟、腎臟的活檢均提示炎癥反應(yīng)持續(xù)存在[12]。因此，抗生素的運(yùn)用并不會(huì)掩蓋感染所致的炎癥反應(yīng)打擊，但抗生素可使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物長期存活以便觀察，而持續(xù)存在的炎癥反應(yīng)損傷又可供探究敗血癥患者痊愈后認(rèn)知功能障礙、免疫抑制的原因等等。同時(shí)，廣譜抗生素也是目前重癥感染的常用治療藥物，這對(duì)模擬人類敗血癥的治療后的臨床情境相符合。

3.2模型可重復(fù)性的評(píng)價(jià)

在10個(gè)不同批次接受標(biāo)準(zhǔn)化手術(shù)方案并輔以抗生素治療的72只小鼠中，以Cronbach’s α系數(shù)法進(jìn)行信度評(píng)價(jià)，比較不同批次間小鼠存活率的可重復(fù)性，得到Cronbach’s α系數(shù)為0.954，大于0.7，說明不同批次間小鼠在不同術(shù)后時(shí)點(diǎn)生存率的可重復(fù)性較高，模型在生存率上的內(nèi)部一致性較好。

3.3局限性分析

優(yōu)化后的CLP敗血癥模型也存在一些缺點(diǎn)：首先，評(píng)價(jià)模型是否成功建立的指標(biāo)比較局限。雖然CLP敗血癥模型可在多種動(dòng)物中建立，其中嚙齒動(dòng)物模型因其建立成本較其他動(dòng)物低，在基礎(chǔ)研究中應(yīng)用十分廣泛。但嚙齒動(dòng)物血量少，在模型建立初期取血往往對(duì)動(dòng)物存活是致命的，會(huì)對(duì)模型的最終死亡率產(chǎn)生干擾，因此通過血培養(yǎng)或檢測急性期炎癥因子水平去驗(yàn)證模型成功率往往難以實(shí)現(xiàn)[3]，這一點(diǎn)難以擬合臨床敗血癥的診斷流程。所以，通過統(tǒng)計(jì)未用藥物或手術(shù)干預(yù)狀態(tài)下CLP術(shù)后動(dòng)物的最終死亡率來提示模型感染和炎癥反應(yīng)嚴(yán)重度[13]。另外，術(shù)后3 h用抗生素，這一時(shí)間間隔往往不同于臨床真實(shí)患者從發(fā)病到接受治療的時(shí)間，因此抗生素輔助治療的效果難以擬合真實(shí)的臨床環(huán)境。

優(yōu)化后的CLP小鼠模型在無抗生素治療情況下一周的死亡率達(dá)86.36%，感染屬于中至重度，輔以廣譜抗生素單藥治療后可長期存活，切口小，術(shù)后局部感染率大大降低。該模型在大樣本量的小鼠中可重復(fù)性好，可用于對(duì)敗血癥后長期預(yù)后的研究與觀察。

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An improved mice model of cecal ligation and perforation for sepsis*

Guo Jia-nan, Liu Wen-yu, Zhou Dong, Tian Lin-yu△

(Department of Neurology, West China Hospital of Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041)

AbstractObjective：To explore how to improve traditional Cecal-ligation and puncture(CLP) procedure. Methods: A total of 103 KM male mice were randomly divided into three groups: antibiotic group, no antibiotic group and sham group. Antibiotic group were treated with imipenem and cilastatin; for sham group, we only open the peritoneum and then closed without therapeutic use of antibiotics. We designed a shorter incision in a new site below xiphoid, changing the dose of antibiotics after surgery and observe the survival rate after surgery. Results: Generally, among all 103 mice accepted the surgery, the survival rate of antibiotic group, no antibiotic group and sham group were with statistically difference(P=0.026). Comparison between each groups showed that: the seven days postoperative survival rate was higher in antibiotic group and no antibiotic group(P<0.001); survival rate in sham group was higher than that in no antibiotic group(P<0.001). However, the survival rate between antibiotic group and sham group has no difference(P=0.331). Cronbach’s α coefficient among 10 batches’s survival rate in antibiotic group is 0.954. Conclusion: Compared with traditional CLP one, improved model has a similar survival rate and a easy standard surgical procedure with smaller incision and a reliable result.

Key Words:Sepsis; Animal model; Surgery procedure; Cecal ligation-and-perforation; Survival rate

(收稿日期：2015-12-22)

作者簡介：郭佳南，女，八年制博士在讀，主要從事神經(jīng)病學(xué)研究工作，Email：875641285@qq.com?！魍ㄓ嵶髡撸禾锪钟簦?，副教授，主要從事神經(jīng)重癥醫(yī)學(xué)臨床研究工作，Email：tianlinyu@sina.com。

*基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81301659)