唐晶　姜鮮　李茂　孫玉紅　章卓△

(1.瀘州醫(yī)學院藥學院藥理教研室，四川 瀘州　646000；

2.達州職業(yè)技術學院藥學教研室，四川 達州　635000；

3.瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院麻醉科，四川 瀘州　646000)

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白藜蘆醇對LPS誘導HUVEC細胞線粒體跨膜電位影響研究*

唐晶1,2姜鮮3李茂1孫玉紅1章卓1△

(1.瀘州醫(yī)學院藥學院藥理教研室，四川 瀘州646000；

2.達州職業(yè)技術學院藥學教研室，四川 達州635000；

3.瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院麻醉科，四川 瀘州646000)

摘要目的：探討白藜蘆醇對LPS刺激HUVEC細胞活性及線粒體跨膜電位影響。方法：體外培養(yǎng)HUVEC，隨機分為LPS組、陰性組、白藜蘆醇160、80、40、20 μg·l(-1)劑量組。其中，LPS組與白藜蘆醇各組分別以1 μg·ml(-1)LPS刺激細胞24 h后，采用CCK-8法檢測細胞活力，熒光顯微鏡下觀察羅丹明染色后細胞線粒體跨膜電位。結果：白藜蘆醇各組均能提高LPS誘導的HUVEC細胞存活率，提高細胞線粒體跨膜電位，與模型組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。結論：白藜蘆醇能提高LPS刺激HUVEC細胞活性，提高細胞線粒體跨膜電位。

關鍵詞：白藜蘆醇；HUVEC細胞；線粒體跨膜電位

血管內(nèi)皮細胞(Vascular endothelial cell，VEC)參與了血管通透性，具有參與機體炎癥反應和免疫應答，調(diào)節(jié)血管舒張、參與止血和趨化白細胞的作用[1]。脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)屬于革蘭陰性菌細胞壁的重要成分，可以通過激活多種細胞因子損傷血管內(nèi)皮細胞，引起血管內(nèi)皮細胞嚴重炎性反應[2]。而炎癥所致血管內(nèi)皮損傷是多種疾病和綜合征發(fā)生、發(fā)展的病理基礎，比如急性肺損傷、動脈粥樣硬化等心血管疾病、創(chuàng)傷、休克、腫瘤等[2]，因此探討尋找保護內(nèi)皮損傷的措施有重要意義。白藜蘆醇(Resveratro1，Res)是多年生草本植物蓼科蓼屬虎杖的根莖中的提取物，廣泛存在于葡萄、花生、虎杖等天然食物或藥物中，具有抗炎、抗血小板聚集、抗氧化等生物藥理活性[3-5]。白藜蘆醇對LPS致HUVEC細胞凋亡保護效應是否與細胞線粒體跨膜電位有關目前仍不清楚。據(jù)此，本文通過觀察不同劑量白藜蘆醇對LPS刺激下HUVEC細胞凋亡保護效應，分析其保護效應是否與影響細胞線粒體跨膜電位有關。

1材料與方法

1.1試劑

白藜蘆醇(陜西森弗生物技術有限公司，批號：20081478，純度98%)；LPS(Sigma，L2880)；HUVEC細胞(購自武漢大學CCTCC細胞庫)；羅丹明123(碧云天生物技術研究所)；RPMI1640培養(yǎng)基，胎牛血清(Hyclone，USA)；CCK-8試劑盒(碧云天生物技術研究所)。

1.2儀器

超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司，SW-CJ-1F型)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司，CKX41型)；酶標分析儀(北京普朗新技術有限公司，DNM-9602型)；熒光顯微鏡(德國LEICA公司，DMR型)。

1.3CCK-8法檢測白藜蘆醇對LPS刺激HUVEC后細胞活性的影響

將LPS配成10 mg·ml-1母液分裝后-20℃凍存?zhèn)溆?。將白藜蘆醇用DMSO與無血清培養(yǎng)基配成640 μg·ml-1母液(DMSO濃度小于0.1%)。HUVEC細胞株采用RPMI1640+10%胎牛血清培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HUVEC細胞，按1×105·ml-1細胞濃度接種于96孔板，每孔90 μl，培養(yǎng)24 h后處理。將細胞分為LPS組(1 μg·ml-1LPS+細胞)，陰性組(細胞+培養(yǎng)基)，空白組(僅有培養(yǎng)基無細胞)以調(diào)整培養(yǎng)基的顏色誤差，白藜蘆醇分為160、80、40、20 μg·l-14個劑量組(白藜蘆醇+1 μg·ml-1LPS+細胞)，溶媒對照組(DMSO+細胞)加終濃度為0.1%DMSO，處理時間為24 h，加入CCK-8 10 μl繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標儀450 nm波長下檢測各孔吸光度值，以OD值反應細胞活力。每個濃度3個復孔，連續(xù)重復3次。

1.4羅丹明染色檢測線粒體跨膜電位

細胞分組同1.4，將不同處理后的HUVEC細胞用0.25%胰酶消化，收集1×l06個細胞，經(jīng)PBS清洗2次，與1 μmol·L-1羅丹明(Rhodamine 123，Rh123)在37℃共同孵育30 min，PBS清洗2次，熒光顯微鏡下觀察熒光強度。

1.5統(tǒng)計學處理

2結果

2.1白藜蘆醇對LPS刺激HUVEC細胞后細胞活性影響

LPS組細胞活力明顯下降，表明LPS抑制HUVEC細胞生長明顯。與LPS組比較，白藜蘆醇160, 80, 40與20 μg·L-1可明顯提高細胞活力，有統(tǒng)計學意義(P<0.05或0.01)，見圖1。

圖1　白藜蘆醇對LPS刺激HUVEC后細胞活力影響注：同LPS組比較，*P<0.05；**P<0.01

2.2白藜蘆醇對LPS刺激HUVEC細胞后對線粒體跨膜電位影響

熒光顯微鏡結果顯示，LPS組熒光較強，表明線粒體跨膜電位較低。陰性對照組熒光較弱，表明線粒體膜完整，線粒體跨膜電位較高。與LPS組比較，白藜蘆醇160, 80, 40 μg·L-1劑量組熒光強度弱于模型組，提示白藜蘆醇各劑量組能夠提高LPS刺激HUVEC細胞后的線粒體跨膜電位，見圖2。

(A)陰性組　　　　　　　　　　　　　　(B)LPS組

(C)Res 160 μg·L-1　　　　　　　　　　　(D)Res 80 μg·L-1

(E)Res 40 μg·L-1　　　　　　　　　　(F)Res 20 μg·L-1圖2　白藜蘆醇對LPS刺激HUVEC后線粒體跨膜電位影響(×200)

3討論

脂多糖致血管內(nèi)皮細胞凋亡機制復雜，但主要與脂多糖激活多種細胞因子，激活NF-κB，改變線粒體跨膜電位有關[6]。線粒體跨膜電位(△ψm)與細胞凋亡間關系密切?！鳓譵是由線粒體內(nèi)膜兩側電子的不對稱分布造成。正常生理情況下，線粒體內(nèi)膜通透性很低，僅允許不帶電荷的小分子物質(zhì)通過，是維持電化學質(zhì)子梯度、進行氧化磷酸化的結構基礎[7]。在細胞凋亡早期，線粒體外膜對蛋白質(zhì)的通透性增高，線粒體內(nèi)膜的跨膜潛能降低。線粒體膜電位降低，可引起細胞凋亡的級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡[8]。本實驗選擇羅丹明染色后熒光顯微鏡檢測線粒體跨膜電位。Rh123是一種可透過細胞膜的陽離子熒光染料，其在正常細胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進入線粒體基質(zhì)，熒光強度減弱或消失。而在凋亡發(fā)生時，線粒體膜完整性破壞，線粒體跨膜電位破壞，Rh123重新釋放出線粒體，發(fā)出強黃綠色熒光。實驗結果顯示，正常細胞熒光較弱，表明線粒體膜完整。LPS刺激后的HUVEC細胞熒光較強，表明線粒體跨膜電位受到破壞。白藜蘆醇干預后可以明顯看見熒光減弱，提示白藜蘆醇減少HUVEC細胞凋亡可能是與提高線粒體跨膜電位有關。

綜上可以看出，脂多糖對血管內(nèi)皮細胞活性影響與線粒體跨膜電位改變有關，白藜蘆醇能夠改善LPS刺激HUVEC細胞后活性，可能與改變HUVEC線粒體跨膜電位有關。但由于白藜蘆醇藥理作用較多，涉及作用機制亦較多，因此白藜蘆醇對血管內(nèi)皮細胞保護作用的機制以及相關應用尚需進一步探討和研究。

參考文獻

1Maier JA. Endothelial cells and magnesium: implications in atherosclerosis[J]. Clin Sci (Lond), 2012, 122(9): 397-407.

2Noratto GD, Angel-Morales G, Talcott ST, et al. Polyphenolics from a?aí(Euterpe oleracea Mart.) and red muscadine grape (Vitis rotundifolia) protect human umbilical vascular endothelial cells (HUVEC) from glucose and lipopolysaccharide(LPS)-induced inflammation and target microRNA-126[J]. J Agric Food Chem, 2011, 59(14): 7999-8012.

3Gresele P, Cerletti C, Guglielmini G, et al. Effects of resveratrol and other wine polyphenols on vascular function: an update[J]. J Nutr Biochem, 2011, 22(7): 201-211.

4Zeuke S, Ulmer A J, Kusumoto S, et al. TLR4-mediated inflammatory activation of human coronary artery endothelial cells by LPS[J]. Cardiovasc Res, 2002, 56(1): 126-134.

5Pirola L, Frojdo S. Resveratrol: one molecule, many targets[J]. IUBMB Life, 2008, 60(5): 323-332.

6Shi Q, Wang J, Wang XL, et al. Comparative analysis of vascular endothelial cell activation by TNF-alpha and LPS in humans and baboons[J]. Cell Biochem Biophys, 2004, 40(3): 289-303.

7Li Y, Shibata Y, Zhang L, et al. Periodontal pathogen aggregatibacter actinomycetemcomitans LPS induces mitochondria-dependent-apoptosis in human placental trophoblasts[J]. Placenta, 2011, 32(1): 11-19.

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Effects of resveratrol on mitochondrial membrane potential of HUVEC cells induced by LPS*

Tang Jing1,2, Jiang Xian3, Li Mao1, Sun Yu-hong1,2, Zhang Zhuo1△(1.Department of Pharmacology, Luzhou Medical College, Sichuan Luzhou 646000;2.Department of Pharmacy, Dazhou Vocational and Technical College, Sichuan Dazhou 63500;3.Department of Anesthesia, Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Sichuan Luzhou 646000)

AbstractObjective：To investigate the effects of resveratrol on the mitochondrial membrane potential of the HUVEC cells induced by LPS. Methods: HUVEC cells were cultured in vitro and divided into LPS group, normal group, 160, 80, 40, 20 μg·L-1resveratrol group. LPS group and resveratrol groups were stimulated by 1 μg·m l-1LPS for 24 h, cell viability was observed by CCK-8; mitochondrial membrane potential were tested by the fluorescence microscope. Results: Compared with model group, resveratrol at the concentration of 160, 80, 40, 20 μg·L-1could increase the cell viability and increase the mitochondrial membrane potential significantly(P<0.05). Conclusion: Resveratrol could against the apoptosis of HUVEC cell induced by LPS, and the mechanism may be associated with the increasion of the mitochondrial membrane potential.

Key Words:Resveratrol; HUVEC cell; Mitochondrial membrane potential

(收稿日期：2015-10-24)

作者簡介：唐晶，女，講師，主要從事神經(jīng)藥理研究，Email：498926268@qq.com?！魍ㄓ嵶髡撸赫伦浚?，副教授，主要從事神經(jīng)與免疫藥理學，Email：zhhuozhang100@163.com。

*基金項目：四川省教育廳課題(編號：14ZA0143)