黎力平 林淼 李龍 鄭龍 朱同玉

·論著·

大鼠腎臟皮質中分離出新型間質細胞
——特絡細胞

黎力平1, 2林淼3李龍1, 2鄭龍1, 2朱同玉1, 2

目的 分析SD大鼠腎臟皮質中特絡細胞(TC)的形態(tài)學及分子生物學特征。方法 手術獲取4周雄性SD大鼠腎臟皮質，使用二型膠原酶等消化酶獲取細胞，利用顯微切割的方法分離純化并原代培養(yǎng)TC。利用相差顯微鏡觀察并鑒定原代培養(yǎng)的TC。免疫熒光檢測TC、成纖維細胞及間充質干細胞(MSC)中CD34、CD117、CD63、Ⅳ型膠原蛋白及層黏連蛋白(LN)的表達情況。利用透射電子顯微鏡(TEM)觀察TC形態(tài)學特征。結果 腎臟皮質中能分離出TC，且可以體外原代培養(yǎng)，其形態(tài)學特征與其他器官中發(fā)現(xiàn)的TC相似。免疫熒光檢測結果發(fā)現(xiàn)TC表達CD117、CD34及CD63 3種細胞表面分子，以及腎小管和腎小球基底膜的主要成分Ⅳ型膠原蛋白及LN，明顯與成纖維細胞及MSC不同。TEM檢測結果發(fā)現(xiàn)，TC位于腎臟皮質的間質區(qū)域、腎小管及血管周圍。結論 大鼠腎臟皮質存在TC，由于其表達CD117、CD34、CD63、Ⅳ型膠原蛋白及LN，提示其可能在促進基底膜再生及腎臟損傷修復過程中發(fā)揮功能。

特絡細胞； 成纖維細胞； 間充質干細胞； 大鼠； 腎臟皮質

1899年，西班牙神經解剖學家卡扎爾在人體胃腸道中首次發(fā)現(xiàn)了一種被稱為“間質神經元”的特殊細胞——卡扎爾細胞[1]。這種細胞被認為是胃腸道起搏器，能夠影響胃腸道活動及神經傳遞[2-3]。Popescu研究團隊發(fā)現(xiàn)了一種與卡扎爾細胞形態(tài)十分相似的間質細胞也存在于消化道以外的空腔器官，當時這種間質細胞被命名為卡扎爾樣間質細胞(interstitial Cajal-like cell，ICLC)[4-5]。但進一步研究表明，ICLC與卡扎爾細胞存在明顯差異，僅形態(tài)學特征就可將ICLC與其他間質細胞區(qū)分開來，因此，Popescu等人[6]認為ICLC可能是一種新型間質細胞。

根據(jù)前期關于ICLC的研究結果，Pospesu等[6]于2010年首次提出并命名了一種特殊類型的間質細胞——特絡細胞(telocyte，TC)；這些間質細胞擁有非常細長的細胞延伸部分(telopod，Tp)，該部分由膨大節(jié)段及細長節(jié)段交替組成。后續(xù)研究進一步闡明了其特征：TC胞體中胞漿含量較少，膨大部分中富含線粒體，細胞間聯(lián)系緊密。目前，TC已被證實存在于多種器官和組織中，包括心臟、肺血管、腸道、腸系膜、膽囊、子宮、輸卵管、胸膜、骨骼肌、胰腺外分泌部、乳腺以及胎盤[7-20]。

腎臟間質可以影響腎臟功能[21-23]，細胞與急性間質性腎炎、慢性移植物排斥反應及缺血再灌注損傷等也有密切聯(lián)系[24-27]。傳統(tǒng)理論認為，成纖維細胞及免疫細胞是腎臟間質中的主要細胞[28]。但傳統(tǒng)概念中的腎臟間質成纖維細胞間存在極大的形態(tài)差異，部分細胞與TC形態(tài)有一定的相似性，因此將這些細胞籠統(tǒng)地全部稱為成纖維細胞并不合適。本研究通過原代分離培養(yǎng)、免疫熒光、透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)等方法分離、鑒定SD大鼠腎臟中的TC，根據(jù)表面標志物比較其與成纖維細胞和間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)的區(qū)別，推測其潛在的功能。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

MSC及腎成纖維細胞均購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司，MSC培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，腎成纖維細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 分離純化及原代培養(yǎng)TC

4周雄性SD大鼠購自復旦大學附屬中山醫(yī)院實驗動物中心，所有動物的使用均通過實驗動物中心倫理審批。動物等級為SPF級。無菌條件下獲取大鼠腎臟皮質，使用無菌剪刀將組織剪成約1 mm×1 mm×1 mm的塊狀，PBS(美國Gibco公司)清洗3次。消化液為使用不含鈣離子及鎂離子的PBS配置的10 mg/mL二型膠原酶(美國Sigma公司)及2 000 U/mL DNA酶(美國Sigma公司)。組織置于37 ℃振蕩器中消化4 h。收集的細胞懸液1 500轉離心5 min，移至40 μm細胞過濾器(美國BD Falcon公司)中過濾。細胞接種于10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。使用相差顯微鏡(IX51-DPT2-CCD，日本奧林巴斯公司)觀察細胞生長。原代細胞及早期幾代細胞中，雜細胞(如腎小管上皮細胞及成纖維細胞)數(shù)量較多，可使用顯微切割方法去除。具體方法：TC成簇生長后，于相差顯微鏡下利用細胞刮刀刮除雜細胞，棄去上層雜細胞懸浮液，PBS沖洗，重復數(shù)次直至鏡下觀察效果滿意，而后行細胞傳代。

1.3 細胞免疫熒光

取大鼠原代TC、腎成纖維細胞及MSC，分別接種于放有無菌蓋玻片的24孔板，每孔接種約1×104個細胞，2～3 d后用PBS清洗3次，每次5 min；-20 ℃預冷甲醇固定20 min，PBS清洗3次，每次5 min；10%胎牛血清白蛋白(美國Gibco公司)室溫封閉1 h，滴加200 μL羊抗大鼠CD34一抗(1/300，美國R&D公司)，4 ℃孵育過夜，PBS清洗3次，每次5 min；然后加200 μL 異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的兔抗羊二抗(1/ 200，美國Jackson公司)，室溫避光孵育1 h，PBS清洗3次，每次5 min；最后用DAPI染核，室溫避光孵育15 min。同時，設立不加一抗的陰性對照，剩余步驟同前，熒光顯微鏡(IX51-DPT2-CCD，日本奧林巴斯公司)下觀察。

檢測CD117表達時使用的一抗為兔抗大鼠CD117(1/300，美國Novus公司)，二抗為Fitc標記的羊抗兔二抗(1/ 200，美國Jackson公司)；檢測Ⅳ型膠原蛋白表達時使用的一抗為兔抗大鼠Ⅳ型膠原蛋白一抗(1/300，美國R&D公司)，二抗為FITC標記的羊抗兔二抗(1/200，美國Jackson公司)；檢測層黏連蛋白(laminin，LN)表達時使用的一抗為兔抗大鼠LN一抗(1/300，美國R&D公司)，二抗為FITC標記的羊抗兔二抗(1/ 200；美國Jackson公司)；檢測CD63表達時使用的一抗為兔抗大鼠CD63一抗(1/100，美國Santa Cruz公司)，二抗為FITC標記的羊抗兔二抗(1/200，美國Jackson公司)。

1.4 TEM

獲取SD大鼠腎臟標本，使用0.1 mol/L的PBS(pH為7.2)配置的2.5%谷氨酰胺固定，而后使用1.0%鋨酸(美國Polysciences公司)固定1 h。去離子水沖洗標本，乙醇梯度脫水(30%、50%、70%、85%、90%乙醇各1次，100%乙醇2次)后使用Eponate 812環(huán)氧樹脂包埋(瑞典Ted Pella公司)，梯度升溫烘干。使用超微顯微鏡薄片切片機(LKB-Ⅱ,德國Leica Microsystems公司)切取組織，厚度為50 nm，3%醋酸鈾和檸檬酸鉛染色。TEM(飛利浦CM120型)觀察，數(shù)碼相機獲取圖片。

2 結 果

2.1 TC原代培養(yǎng)

在相差顯微鏡下能觀察到富含細長念珠狀突起的紡錘形細胞，與TC的形態(tài)標準相符合(見圖1)。一個典型的TC有1個Tp，該Tp中含有多個細長部分和膨大部分；另一個TC有多個Tp。TC呈紡錘形，隨著細胞密度的增加，細胞的突起也更多。

注： TC. 特絡細胞；Tp. 細胞延伸部分； 圖中可見數(shù)個TC，其中一個TC有1個Tp；另一個TC有多個Tp，并與其他TC有聯(lián)系

2.2 TC表面標志物

我們利用細胞免疫熒光檢測CD117、CD34及CD63 3種細胞表面分子和腎小管、腎小球基底膜主要成分Ⅳ型膠原蛋白及LN的表達。檢測結果發(fā)現(xiàn)，原代培養(yǎng)的TC表達CD34、CD117及CD63，高表達Ⅳ型膠原蛋白及LN(見圖2)。MSC不表達CD34，低表達CD117及CD63，高表達Ⅳ型膠原蛋白及LN；腎成纖維細胞不表達CD34、LN及CD63，表達CD117及Ⅳ型膠原蛋白(見圖3～4)。

注： 原代培養(yǎng)的特絡細胞表達CD34(圖2a)、CD117(圖2b)及CD63(圖2c)，高表達層黏連蛋白(圖2d)及Ⅳ型膠原蛋白(圖2e)

注： 間充質干細胞不表達CD34(圖3a)，低表達CD117(圖3b)及CD63(圖3c)，高表達層黏連蛋白(圖3d)及Ⅳ型膠原蛋白(圖3e)

注： 成纖維細胞不表達CD34(圖4a)、CD63(圖4c)及層黏連蛋白(圖4d)，低表達CD117(圖4b)及IV型膠原蛋白(圖4e)

2.3 定位腎臟TC并分析其形態(tài)特征

我們使用TEM定位腎臟標本中TC，分析其在體形態(tài)學特征。發(fā)現(xiàn)TC位于腎小管及血管的周圍，以其非常細長且彎曲Tp包繞內皮細胞或基底膜，其細長節(jié)段及膨大節(jié)段結構清晰可見(見圖5)。同時發(fā)現(xiàn)TC在活體中不止存在1個Tp，TC的形態(tài)與Tp的數(shù)量有關。

注： 可見典型的特絡細胞(TC)，其有特征性的細胞延伸部分(Tp)、膨大節(jié)段及細長節(jié)段(圖5a)；TC位于腎小管及血管的周圍，可見到腎小管基底膜(BM)、內皮細胞(E)、線粒體(m)及紅細胞(RBC)(圖5b)

3 討 論

研究證實多種器官與組織中都存在TC，這些研究分別利用細胞培養(yǎng)、免疫熒光及TEM等方法分離和鑒定TC[7-20]。目前TC的公認特征如下：(1)位于腎小管外的間質部位；(2)胞體呈紡錘形、梭形或多角邊形；(3)富含Tp，Tp能產生分枝并與周圍細胞及組織形成廣泛聯(lián)系；(4)膨大節(jié)段及核周胞漿中富含線粒體；(5)細胞表面標志物CD117及CD34陽性。

本研究分離鑒定的細胞均具有以上特征。細胞培養(yǎng)、TEM均提示TC位于腎臟皮質的間質區(qū)域。細胞原代培養(yǎng)中能觀察到形態(tài)典型的TC。免疫熒光檢測結果顯示其表達CD34及CD117，與MSC及腎成纖維細胞有明顯區(qū)別。TEM發(fā)現(xiàn)TC多存在于血管及腎小管周圍并以Tp包繞基底膜。因此，形態(tài)特征及細胞表面標志物可以證明在腎臟皮質中發(fā)現(xiàn)的新型間質細胞是TC。

雖然在多種器官及組織中已證實TC的存在，但關于其具體功能的研究仍比較缺乏。有研究發(fā)現(xiàn)，在心臟缺血再灌注損傷的體外實驗中，心臟干細胞及TC共培養(yǎng)能促進心臟干細胞的增殖，相似結果在骨骼肌再生的實驗中也得到證實[29-30]。Manole等[31]通過建立大鼠急性心梗死模型發(fā)現(xiàn)，TC會在新生的血管周圍聚集，免疫組織化學法證實其能通過旁分泌的方式分泌血管內皮生長因子或一氧化氮合酶，促進血管再生，此外還發(fā)現(xiàn)TC表達多種血管再生相關微RNA。另有研究證實，于心臟缺血30 min 內行TC回輸能減少心肌梗死面積、改善心臟功能[32]。有學者將血管周圍的各種腫瘤細胞分子標志物與TC進行比較，發(fā)現(xiàn)TC與某些腫瘤有潛在的關系，他們進一步利用免疫組織化學法分析相關正常組織及腫瘤病理標本，提出了TC可能與多個器官的某些病理改變密切相關的假設[33-34]。

我們研究發(fā)現(xiàn)TC主要聚集于腎血管及腎小管周圍，同時TC高表達Ⅳ型膠原蛋白及LN，而Ⅳ型膠原蛋白及LN是血管及腎小管基底膜的主要成分，提示TC與腎小管基底膜和腎內血管穩(wěn)定性可能存在聯(lián)系。有研究通過基因表達譜也發(fā)現(xiàn)TC與MSC及成纖維細胞間基因表達存在明顯差異，TC高表達基質金屬蛋白酶3(matrix metallopeptidase 3，MMP3)、金屬蛋白酶組織抑制劑3(tissue inhibitor of metalloproteinase 3，TIMP3)及Ⅳ型膠原蛋白α等基因[35]。而MMP3與TIMP3能維持基底膜的動態(tài)平衡，這些證據(jù)進一步提示TC在腎臟再生修復中可能發(fā)揮重要的作用。

此外，我們研究發(fā)現(xiàn)TC也表達CD63分子，該分子能夠激活金屬蛋白酶組織抑制劑1-CD63-整合素β1信號轉導通路，繼而通過激活PI3K-ERK信號通路中的關鍵蛋白分子，發(fā)揮抑制內源性及外源性細胞凋亡途徑的作用[36]。TC作為間質來源細胞，有較強的抗損傷能力，CD63可能是其抗損傷的關鍵分子之一。

綜上所述，我們在大鼠腎臟皮質中分離并鑒定了TC，并發(fā)現(xiàn)其主要位于腎血管及腎小管周圍，表達Ⅳ型膠原蛋白、LN及CD63分子，提示其可能有促進基底膜再生及腎臟損傷修復的功能。

1 Llinas RR. The contribution of Santiago Ramon y Cajal to functional neuroscience[J]. Nat Rev Neurosci, 2003, 4(1):77-80.

2 Hirst GD, Ward SM. Interstitial cells: involvement in rhythmicity and neural control of gut smooth muscle[J]. J Physiol, 2003, 550(Pt 2):337-346.

3 Sanders KM, Koh SD, Ward SM. Interstitial cells of cajal as pacemakers in the gastrointestinal tract[J]. Annu Rev Physiol, 2006, 68:307-343.

4 Hinescu ME, Gherghiceanu M, Mandache E, et al. Interstitial Cajal-like cells (ICLC) in atrial myocardium: ultrastructural and immunohistochemical characterization[J]. J Cell Mol Med, 2006, 10(1):243-257.

5 Hinescu ME, Popescu LM. Interstitial Cajal-like cells (ICLC) in human atrial myocardium[J]. J Cell Mol Med, 2005, 9(4):972-975.

6 Popescu LM, Faussone-Pellegrini MS. TELOCYTES - a case of serendipity: the winding way from Interstitial Cells of Cajal (ICC), via Interstitial Cajal-Like Cells (ICLC) to TELOCYTES[J]. J Cell Mol Med, 2010, 14(4):729-740.

7 Gherghiceanu M, Popescu LM. Cardiomyocyte precursors and telocytes in epicardial stem cell niche: electron microscope images[J]. J Cell Mol Med, 2010,14(4):871-877.

8 Gherghiceanu M, Manole CG, Popescu LM. Telocytes in endocardium: electron microscope evidence[J]. J Cell Mol Med, 2010,14(9):2330-2334.

9 Popescu LM, Gherghiceanu M, Hinescu ME, et al. Insights into the interstitium of ventricular myocardium: interstitial Cajal-like cells (ICLC)[J]. J Cell Mol Med, 2006,10(2):429-458.

10 Mandache E, Popescu LM, Gherghiceanu M. Myocardial interstitial Cajal-like cells (ICLC) and their nanostructural relationships with intercalated discs: shed vesicles as intermediates[J]. J Cell Mol Med, 2007, 11(5):1175-1184.

11 Kostin S, Popescu LM. A distinct type of cell in myocardium: interstitial Cajal-like cells (ICLCs)[J]. J Cell Mol Med, 2009, 13(2):295-308.

12 Suciu L, Popescu LM, Regalia T, et al. Epicardium: interstitial Cajal-like cells (ICLC) highlighted by immunofluorescence[J]. J Cell Mol Med, 2009, 13(4):771-777.

13 Li L, Lin M, Li L, et al. Renal telocytes contribute to the repair of ischemically injured renal tubules[J]. J Cell Mol Med, 2014, 18(6):1144-1156.

14 Gherghiceanu M, Hinescu ME, Andrei F, et al. Interstitial Cajal-like cells (ICLC) in myocardial sleeves of human pulmonary veins[J]. J Cell Mol Med, 2008, 12(5A):1777-1781.

15 Zheng Y, Li H, Manole CG, et al. Telocytes in trachea and lungs[J]. J Cell Mol Med, 2011, 15(10):2262-2268.

16 Qi G, Lin M, Xu M, et al. Telocytes in the human kidney cortex[J]. J Cell Mol Med, 2012, 16(12):3116-3122.

17 Popescu LM, Ciontea SM, Cretoiu D. Interstitial Cajal-like cells in human uterus and fallopian tube[J]. Ann N Y Acad Sci, 2007, 1101:139-165.

18 Hinescu ME, Gherghiceanu M, Suciu L, et al. Telocytes in pleura: two- and three-dimensional imaging by transmission electron microscopy[J]. Cell Tissue Res, 2011, 343(2):389-397.

19 Suciu L, Popescu LM, Gherghiceanu M. Human placenta: de visu demonstration of interstitial Cajal-like cells[J]. J Cell Mol Med, 2007, 11(3):590-597.

20 Gherghiceanu M, Popescu LM. Interstitial Cajal-like cells (ICLC) in human resting mammary gland stroma. Transmission electron microscope (TEM) identification[J]. J Cell Mol Med, 2005, 9(4):893-910.

21 Hou Y, Wang X, Li L, et al. FHL2 regulates hematopoietic stem cell functions under stress conditions[J]. Leukemia, 2015, 29(3):615-624.

22 Hou Y, Li W, Sheng Y, et al. The transcription factor Foxm1 is essential for the quiescence and maintenance of hematopoietic stem cells[J]. Nat Immunol, 2015, 16(8):810-818.

23 Takehara Y, Yabuuchi A, Ezoe K, et al. The restorative effects of adipose-derived mesenchymal stem cells on damaged ovarian function[J]. Lab Invest, 2013, 93(2):181-193.

24 Lin M, Li L, Li L, et al. The protective effect of baicalin against renal ischemia-reperfusion injury through inhibition of inflammation and apoptosis[J]. BMC Complement Altern Med, 2014, 14(1):1-9.

25 Zhang C, Zheng L, Li L, et al. Rapamycin protects kidney against ischemia reperfusion injury through recruitment of NKT cells[J]. J Transl Med, 2014, 12(1):224-224.

26 Tanaka T, Nangaku M. Pathogenesis of tubular interstitial nephritis[J]. Contrib Nephrol, 2011, 169:297-310.

27 Lee S, Huen S, Nishio H, et al. Distinct macrophage phenotypes contribute to kidney injury and repair[J]. J Am Soc Nephrol, 2011, 22(2):317-326.

28 Kaissling B, Hegyi I, Loffing J, et al. Morphology of interstitial cells in the healthy kidney[J]. Anat Embryol (Berl), 1996, 193(4):303-318.

29 Popescu LM, Manole E, Serboiu CS, et al. Identification of telocytes in skeletal muscle interstitium: implication for muscle regeneration[J]. J Cell Mol Med, 2011,15(6):1379-1392.

30 Popescu LM, Gherghiceanu M, Manole CG, et al. Cardiac renewing: interstitial Cajal-like cells nurse cardiomyocyte progenitors in epicardial stem cell niches[J]. J Cell Mol Med, 2009, 13(5):866-886.

31 Manole CG, Cismasiu V, Gherghiceanu M, et al. Experimental acute myocardial infarction: telocytes involvement in neo-angiogenesis[J]. J Cell Mol Med, 2011, 15(11):2284-2296.

32 Zhao B, Chen S, Liu J, et al. Cardiac telocytes were decreased during myocardial infarction and their therapeutic effects for ischaemic heart in rat[J]. J Cell Mol Med, 2013, 17(1):123-133.

33 Ardeleanu C, Bussolati G. Telocytes are the common cell of origin of both PEComas and GISTs: an evidence-supported hypothesis[J]. J Cell Mol Med, 2011, 15(12):2569-2574.

34 Li L, Li B, Shao J, et al. Chemotherapy sorting can be used to identify cancer stem cell populations[J]. Mol Biol Rep, 2012, 39(11):9955-9963.

35 Zheng Y, Zhang M, Qian M, et al. Genetic comparison of mouse lung telocytes with mesenchymal stem cells and fibroblasts[J]. J Cell Mol Med, 2013, 17(4):567-577.

36 Stetler-Stevenson WG. Tissue inhibitors of metalloproteinases in cell signaling: metalloproteinase-independent biological activities[J]. Sci Signal, 2008, 1(27):re6.

(本文編輯：徐小明)

黎力平, 林淼, 李龍, 等. 大鼠腎臟皮質中分離出新型間質細胞——特絡細胞[J/CD]. 中華移植雜志: 電子版, 2016, 10(2): 81-84,96.

A new type of interstitial cell in rat renal cortex: telocyte

LiLiping1, 2,LinMiao3,LiLong1, 2,ZhengLong1, 2,ZhuTongyu1, 2.

1DepartmentofUrology,2ShanghaiKeyLabofOrganTransplantation,3DepartmentofThoracicSurgery,ZhongshanHospital,AffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai200032,China

ZhuTongyu,Email:tyzhu@fudan.edu.cn

Objective To investigate the morphological and molecular biological features of telocyte(TC)in rat renal cortex. Methods Kidneys of four weeks old SD rats were taken from surgery. The method of microdissection was used to isolate and purify TC. Phase contrast microscope was used to observe and identify TC in rat renal cortex. Immunofluorescence was used to detect the molecular biomarkers including CD34, CD117, CD63, collagen Ⅳ and laminin of TC, fibroblast and mesenchymal stem cell. Transmission electron microscope (TEM) was used to observe the morphological features of TC. Results Typical TC could be isolated from rat renal cortex, whose morphological features were similar to TC which was found in other organs. The experimental results of immunofluorescence showed that CD34, CD117, CD63, and collagen Ⅳ and laminin were expressed in TC, which was obviously different from fibroblast and mesenchymal stem cell. Typical TC observed by TEM was ditributed around blood capillaries and renal tubules in rat kidney interstitium. Conclusions TC expressing CD34, CD117, CD63, collagen Ⅳ and laminin could be found in kidney interstitium, which prompted us that they might play a role during processes like basement membranes regeneration and kidney injury recovery.

Telocyte; Fibroblast; Mesenchymal stem cell; Rat; Renal cortex

10.3877/cma.j.issn.1674-3903.2016.02.007

200032 上海，復旦大學附屬中山醫(yī)院泌尿外科1, 上海市器官移植重點實驗室2, 胸外科3

朱同玉, Email: tyzhu@fudan.edu.cn

2016-04-22)