郭焰，豆一玲，白羽嘉，黃文書，馮作山，*（.新疆輕工職業(yè)技術學院，新疆烏魯木齊8300；.新疆農業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊83005）

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不同提取條件對玫瑰花中總黃酮品質的影響

郭焰1，豆一玲1，白羽嘉2，黃文書2，馮作山2，*
（1.新疆輕工職業(yè)技術學院，新疆烏魯木齊830021；2.新疆農業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052）

摘要：利用單因素試驗和正交試驗的方法，研究在微波輔助下，以乙醇為萃取劑提取新疆南疆地區(qū)玫瑰花中總黃酮的工藝條件，并對提取的總黃酮進行定性分析與吸附純化。結果表明，最佳提取工藝條件是乙醇濃度50 %、料液比1∶20（g/mL）、微波時間40s、微波功率900 W、提取2次。此條件下玫瑰花中總黃酮含量為3.73 %。通過顏色反應初步鑒定玫瑰花黃酮提取液，確定其中含有黃酮及黃酮醇類等成分。利用AB-8大孔樹脂吸附純化玫瑰花總黃酮，通過吸附、解吸實驗，結果顯示，吸附率37.58%，解析率48.50%，純度25.4%。

關鍵詞：玫瑰花；總黃酮；微波提取；定性分析；大孔樹脂

玫瑰花，為薔薇科薔薇，屬多年生常綠或落葉灌木，含有多種維生素、脂肪酸、氨基酸、微量元素、多種糖類和豐富的花青素、黃酮類物質、生物堿等活性成分[1]。以其具有的較高藥用和營養(yǎng)價值，吸引了越來越多人們的關注。新疆南疆地區(qū)有大量的適應性強、產量高的玫瑰資源，這里的玫瑰花主要用于加工玫瑰醬、玫瑰花茶、玫瑰精油，產品品種少、附加值低，未能充分利用。

黃酮類物質是自然界藥用植物中主要活性成分之一。眾多研究表明：黃酮類物質具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗衰老以及防止骨質疏松、保護心血管、降血脂等療效[2]。傳統(tǒng)的黃酮提取方法存在操作繁瑣、提取率低、溶劑用量大等缺點，而微波輔助提取方法具有安全、快速、選擇性好、穿透力強等優(yōu)點，是近年來發(fā)展起來的一種新技術[3]。在天然產物的富集和分離純化中廣泛應用的大孔樹脂以其物理化學穩(wěn)定高、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、易解吸、成本低等特點呈現(xiàn)良好的發(fā)展趨勢[4]。

本試驗將微波技術用于玫瑰花總黃酮的提取，采用正交設計法對微波輔助提取玫瑰花總黃酮的工藝條件進行優(yōu)選，測定最佳提取條件下的玫瑰花總黃酮含量，采用顏色反應對提取液中的總黃酮類化合物進行初步定性分析，同時采用大孔樹脂對提取液中的總黃酮進行富集、純化，旨在促進新疆玫瑰花的精深加工和綜合利用技術的發(fā)展。

1　材料與儀器

1.1材料

新鮮玫瑰花：新疆喀什玫源公司提供，干燥，粉碎，過20目篩。

1.2儀器

TU-1810PC型紫外-可見分光光度計：北京普析通用公司；WD900ASL23-2型微波爐：LG電子（天津）電器有限公司；HH－4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；101型電熱鼓風干燥箱：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；BS224S分析天平：北京賽多利斯儀器設備有限公司；LD4-2A型離心機：北京醫(yī)用離心機廠；N-1001型旋轉蒸發(fā)儀：上海愛朗儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠。

1.3試劑

蘆丁標準品：生化試劑，購自Sigma公司；95 %乙醇、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、三氯化鋁、濃硫酸、鹽酸、鎂粉、醋酸鎂、氨水、三氯化鐵、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、正丁醇：均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；AB-8（D-101）大孔吸附樹脂：天津市光復精細化工研究所。

2　方法

2.1總黃酮提取劑選擇

用無水乙醇、50 %乙醇、水、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、正丁醇、甲醇各40 mL對玫瑰花浸提、過夜后過濾，提取液經水浴濃縮后進行干燥、溶解試驗。結果發(fā)現(xiàn)，上述有機溶劑對玫瑰花中總黃酮均有一定的抽提效果，其中以50 %乙醇、甲醇的抽提效果最好，從提取液、干燥物、溶解時顏色一直很穩(wěn)定，而其它提取劑有不同程度的顏色變化。乙醇對天然植物細胞有較強的穿透能力，且提取液透亮不易發(fā)霉變質，較之甲醇毒性小，因此，本試驗采用50 %乙醇溶液作為提取劑。

2.2提取與純化工藝流程

2.3總黃酮含量測定方法

玫瑰花中總黃酮含量測定采用硝酸鋁分光光度法[5]。

2.3.1制作標準曲線

精確稱取干燥至恒重的蘆丁標準品0.003 1 g，用50%乙醇溶解，定容到100mL容量瓶中，制成31.0 μg/mL的蘆丁標準溶液。分別移取該標準液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于25 mL容量瓶中，加5 %亞硝酸鈉溶液1.00 mL，混勻，放置6 min，加10 %硝酸鋁溶液1.00 mL，搖勻，放置6 min，加10 %氫氧化鈉試液10.00 mL，用50 %乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15 min，以蘆丁空白為對照，用1 cm比色皿在510 nm波長處測定吸光度A。以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。計算回歸方程為：y=0.102 5x-0.000 4，（R2=0.999 1）。

2.3.2樣品測定

吸取1.00 mL提取液于25 mL容量瓶中，按照上述方法，測定提取液的吸光度。通過標準曲線的回歸方程換算成濃度Y（mg/mL），則玫瑰花提取液中總黃酮含量C（%）：

C/% = 100×（Y×100×25）/（2×1 000）

2.4總黃酮提取工藝單因素試驗

準確稱取1.00 g玫瑰花粉末3份于3個100 mL燒杯中，分別在不同的乙醇濃度、料液比、提取時間、微波功率、提取次數(shù)等條件下進行試驗?？疾鞂傸S酮提取率的影響，以確定相關因素及其范圍。

2.5正交試驗優(yōu)化總黃酮提取工藝

根據(jù)單因素試驗結果，選擇料液比、提取時間、乙醇濃度3個因素，進行L9（34）的正交試驗，對玫瑰花中總黃酮提取條件進行優(yōu)化。正交設計方案見表1。

表1正交試驗因素水平表Table 1 Factor and level of orthogonal experiment test

2.6玫瑰花總黃酮定性分析[6-7]

2.6.1鹽酸—鎂粉還原反應

取樣品液1.00 mL于試管中，加入少許鎂粉及濃鹽酸，振搖，觀察顏色變化。

2.6.2濃硫酸顯色劑試驗

取樣品液1.00 mL于試管中，加入濃硫酸數(shù)滴，振搖，噴于濾紙上，吹干，觀察顏色變化。

2.6.3氨水顯色劑試驗

用玻璃棒蘸取樣品液點在濾紙上，吹干，將濾紙放在氨水上方熏0.5 min左右，觀察顏色變化。

2.6.4三氯化鋁絡合反應

用玻璃棒蘸取樣品液點在濾紙上，吹干，噴1 %三氯化鋁乙醇溶液，吹干，于紫外光下觀察顏色變化。

2.6.5醋酸鎂絡合反應

用玻璃棒蘸取樣品液點在濾紙上，吹干，噴1 %醋酸鎂甲醇溶液，吹干，于紫外光下觀察顏色變化。

2.6.6三氯化鐵酚羥基反應

取樣品液1.00 mL于試管中，加入數(shù)滴1 %三氯化鐵乙醇溶液，振搖，觀察顏色變化。

2.7玫瑰花總黃酮的純化

2.7.1大孔吸附樹脂的預處理[8]

將AB-8樹脂用95 %乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹，用乙醇清洗至洗出液無白濁色為止，再以蒸餾水洗去乙醇至無醇味，然后酸堿處理，再用蒸餾水清洗至洗出液呈中性。

以乙醇濕法裝柱，用95 %乙醇在柱上流動清洗，檢查流出的乙醇與水混合不呈白濁色為止，然后以大量蒸餾水洗去乙醇，避免因為少量乙醇的存在而降低大孔吸附樹脂的吸附力。

將玫瑰花黃酮提取液直接加到已經處理好的大孔吸附樹脂柱頂。濃縮液經大孔吸附樹脂柱分離，以50 %乙醇為洗脫溶劑進行洗脫，收集洗脫液并濃縮。2.7.2 AB-8樹脂對總黃酮的靜態(tài)吸附量與解吸率測定[9]

準確稱取5.000 0 g預處理好的濕樹脂于100 mL具塞三角瓶中，加入一定濃度（C0）的玫瑰花黃酮提取液10 mL，在30℃下振蕩24 h，過濾，得濾液1，測其黃酮濃度（C1）。按下式計算吸附量和吸附率。

吸附率A/% =（C0- C1）/C0×100

吸附量Q/（mg/g）=（C0- C1）×V/W

式中：C0為粗提液原液濃度，mg/mL；C1為吸附后剩余溶液濃度，mg/mL；C2為洗脫液濃度，mg/mL；V為吸附溶液體積，mL；W為樹脂重量，g。

將充分吸附后的樹脂用蒸餾水清洗至樹脂表面無提取溶液殘留，濾紙吸干樹脂表面殘留的溶液，然后置于100 mL具塞三角瓶中，加入無水乙醇50 mL，在30℃下振蕩解析24 h，過濾，得濾液2，測其黃酮濃度（C2）。按下式計算解吸率。

解吸率D/% =（V×C2）/（W×Q）×100

式中：V為解吸液體積，mL；C2為解吸后溶液中總黃酮濃度，mg/mL。

2.7.3 AB-8樹脂對總黃酮的動態(tài)吸附量與解吸率測定[9]

常規(guī)濕法裝柱，將一定體積、一定濃度的粗提液注入樹脂柱中，待樣品溶液全部通過樹脂柱后用去離子水洗至流出液基本無色時，加入一定體積的洗脫劑，收集洗脫液，檢測其濃度，然后將洗脫液經旋轉蒸發(fā)濃縮。真空干燥，稱量質量，計算后可得黃酮純度與得率。

純度/% =（X×V/G）×100

得率/% = X×V/（X樣×V樣）×100

式中：X為洗脫液中黃酮濃度，mg/mL；V為洗脫液體積，mL；X樣為上樣樣品中黃酮濃度，mg/mL；V樣為上樣體積，mL；G為洗脫液濃縮烘干后的固形物重量，mg。

3　結果與分析

3.1總黃酮提取條件的確定

3.1.1不同提取次數(shù)對提取效果的影響提取次數(shù)對提取效果的影響見圖1。

圖1提取次數(shù)對提取效果的影響Fig.1 The effect of extraction times on extraction efficiency

由圖1可知，提取3次的吸光度值為0.950，提取2次的吸光度值已達到0.930。表明提取2次已將玫瑰花中絕大多數(shù)的黃酮類化合物提取出來，因此可確定最佳提取次數(shù)為2次。

3.1.2不同乙醇濃度對提取效果的影響

提取劑濃度對提取效果的影響見圖2。

圖2提取劑濃度對提取效果的影響Fig.2 The effect of concentration on extraction efficiency

由圖2可見，黃酮提取效果隨乙醇濃度的增大有下降的趨勢，50 %的乙醇濃度為較好的提取條件，提取液的吸光度值為0.860，乙醇濃度對黃酮提取效果影響較大。

3.1.3不同微波時間對提取效果的影響

提取時間對提取效果的影響見圖3。

圖3提取時間對提取效果的影響Fig.3 The effect of time on extraction efficiency

結果表明，黃酮提取效果隨著微波時間的延長呈上升趨勢，但延長到一定程度時反而下降了。40 s時細胞中的有效成分已完全溶出，再延長時間，非但不能獲得較好的提取效果，反而會導致黃酮因受熱降解，因此選擇提取時間為40 s為適宜條件。

3.1.4不同微波功率對提取效果的影響

微波功率對提取效果的影響見圖4。

圖4微波功率對提取效果的影響Fig.4 The effect of microwave power on extraction efficiency

由圖4看出，黃酮提取效果隨微波功率的增大而增加，微波功率為900 W時提取效果最好，由于試驗設備的局限，未能試驗更高微波功率對黃酮提取效果的影響。

3.1.5不同料液比對提取效果的影響

料液比對提取效果的影響見圖5。

由圖5可知，提取效果隨料液比的增大呈上升趨勢，但增加到一定程度就趨于平穩(wěn)，增加料液比意味著溶劑用量的增加和后續(xù)溶劑回收能耗增大。一般來說，只要能將活性物質溶出，料液比越小越好，料液比為1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）的提取液吸光度值變化很小，說明料液比達到1∶20（g/mL）能將玫瑰花中黃酮提取比較完全，從經濟角度考慮，選取料液比為1∶20（g/mL）適宜。

圖5料液比對提取效果的影響Fig.5 The effect of liquid to solid ratio on extraction efficiency

3.2正交試驗設計結果

在上述單因素試驗的基礎上，采用L9（34）正交試驗對玫瑰花中總黃酮提取條件進行優(yōu)化，確定最佳的提取工藝條件。結果見表2。

表2正交結果分析表Table 2 The result of orthogonal test

由表2可知，影響玫瑰花中總黃酮提取效果的主次順序依次是料液比＞乙醇濃度＞微波處理時間；同時綜合上述單因素試驗結果，得到玫瑰花中總黃酮提取的最優(yōu)工藝條件為A2B2C2，即料液比1∶20（g/mL），乙醇濃度50 %，微波處理時間40 s。取3份玫瑰花樣品以最優(yōu)試驗條件做驗證試驗，測得吸光度平均值為0.874 5，與正交分析結果相符。

3.3總黃酮含量測定結果

在正交試驗優(yōu)化微波輔助提取玫瑰花中總黃酮的最優(yōu)技術條件下，得出玫瑰花中總黃酮含量為3.73%。3.4提取液定性分析結果

對玫瑰花黃酮提取液進行定性分析，與蘆丁溶液的顯色結果進行比較，見表3。

表3顏色反應鑒定結果Table 3 Results of identification of the reaction of color

由黃酮定性顯色反應可以判斷玫瑰花黃酮提取液中可能含有黃酮，黃酮醇，二氫黃酮等黃酮類化合物。3.5玫瑰花總黃酮純化結果

用AB-8大孔吸附樹脂對玫瑰花渣中黃酮類化合物進行純化，吸附率37.58 %，解析率48.50 %，純度25.4 %。結果見表4、表5。

表4靜態(tài)吸附與解吸結果Table 4 Result on static adsorption and desorptio

表5動態(tài)吸附與解吸結果Table 5 Dynamic adsorption and desorptio　%

4　結論

1）影響玫瑰花總黃酮提取效果的主次順序依次是料液比＞乙醇濃度＞微波時間，新疆玫瑰花總黃酮的最佳提取條件為乙醇濃度50 %，微波輻射時間40 s，料液比1∶20（g/mL），微波功率900 W，提取次數(shù)2次，此條件下玫瑰花中總黃酮含量為3.73 %。

2）通過顏色反應鑒定玫瑰花黃酮提取液，結果顯示玫瑰花總黃酮類化合物包括黃酮及黃酮醇類等成分。

3）利用AB-8大孔樹脂吸附純化玫瑰花總黃酮，吸附率37.58 %，解析率48.50 %，純度25.4 %。

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Influence of Different Extracting Methods on Flavonoids in Roses

GUO Yan1，DOU Yi-ling1，BAI Yu-jia2，HUANG Wen-shu2，F(xiàn)ENG Zuo-shan2，*
（1. Xinjiang Institute of Light Industry Vocational and Technical，Urumqi 830021，Xinjiang，China；2. College of Food Scicnce and Medicine，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，Xinjiang，China）

Abstract：Using single factor and orthogonal test method，studied on microwave-assisted extracting total flavonoids from rose in Southern Xinjiang，and the extraction of flavonoids were qualitatively analyzed and adsorption purification. The results showed that the optimum extracting technology were as follows：alcohol contraction 50 %，solid-liquid ratio 1∶20（g/mL），microwave extraction time 40 s，microwave power 900 W，extraction 2 times. On these conditions，the total content of flavonoids in the roses was 3.73 %. Flavone and flavonol were identified by initial color authentication in flavonoids.The AB-8 macroporous resin was used to purify total flavonoids of rose，adsorption and desorption experiment results showed that：adsorption rate 37.58 %，desorption rate 48.50 %，purity 25.4 %.

Key words：rose；flavonoids；microwave-assisted extraction；qualitative analysis；macroporous resin

收稿日期：2015-06-13

*通信作者：馮作山，教授，博士，研究方向：農產品貯藏與加工研究。

作者簡介：郭焰（1967—），女（回），高級實驗師，碩士，研究方向：食品加工原理及技術。

基金項目：教育部“春暉計劃”合作科研項目（Z2006-1-83001）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.025