曾諦，王玉濤，黃琴，龍為，朱思明，*（.華南理工大學(xué)輕化工研究所，廣東廣州50640；2.喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆喀什844006；3.喀什大學(xué)新疆自治區(qū)教育廳葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究實(shí)驗(yàn)室，新疆喀什844006）

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粗子草總黃酮的提取工藝研究

曾諦1，3，王玉濤2，3，黃琴1，龍為1，朱思明1，*
（1.華南理工大學(xué)輕化工研究所，廣東廣州510640；2.喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆喀什844006；3.喀什大學(xué)新疆自治區(qū)教育廳葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究實(shí)驗(yàn)室，新疆喀什844006）

摘要：粗子草是一種稀有的傘形科藥用植物，當(dāng)?shù)厝伺莶栾嬘每捎米隹寡准敖笛獕河谩Ｒ砸掖紴樘崛?，設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)，考察了乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度對粗子草中總黃酮得率的影響。結(jié)果表明：粗子草富含黃酮；各因素對粗子草總黃酮提取的影響順序是：提取溫度＞乙醇濃度＞料液比＞提取時(shí)間；粗子草總黃酮最佳提取工藝為：乙醇濃度60 %，料液比1∶30（g/mL），提取時(shí)間90min，提取溫度60℃。研究可為藥用植物粗子草的保護(hù)性開發(fā)提供參考。

關(guān)鍵詞：粗子草；總黃酮；提取

黃酮類化合物是植物的次級代謝產(chǎn)物，廣泛的存在于植物的果實(shí)和種子中[1]。據(jù)報(bào)道，黃酮有清除體內(nèi)自由基、消炎、降低高血壓等作用。粗子草，被子植物門（Angiospermae）、雙子葉植物綱（Dicotyledoneae）、原始花被亞綱（Archichlamydeae）、傘形目（Umbelliflorae）、傘形科（Umbelliferae）、瘤果芹屬（Trachydium）[2]。粗子草生于高山草甸中，或林下，屬多年生草本。瘤果芹屬藥用植物，國內(nèi)外均未對其展開系統(tǒng)的研究和開發(fā)。在中國高海拔地區(qū)，當(dāng)?shù)厝罕娨恢睂⑵渥鳛樗幬锱莶栾嬘?，尤其是世代生存在帕米爾高原（平均海? 000 m）的塔吉克族群眾，以泡茶飲用來消炎和降血壓用，國內(nèi)目前對粗子草的研究鮮有報(bào)道。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對從植物中提取總黃酮進(jìn)行了大量的研究。黃酮的提取與分離，在醫(yī)藥食品等領(lǐng)域有著巨大的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)[3]。本文以粗子草為原料，采用傳統(tǒng)的乙醇浸提法，先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，再進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定其乙醇提取的最佳工藝。為粗子草的進(jìn)一步研究提供參考。

1　材料和方法

1.1材料與試劑

粗子草：采自新疆帕米爾高原，海拔5 000 m以上；蘆?。荷虾＞Ъ兩萍脊煞萦邢薰?；無水乙醇（AR）：天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉（AR）：廣州化學(xué)試劑廠；亞硝酸鋁、氫氧化鈉（AR）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

HHS-2S型恒溫水浴鍋：上海宜昌儀器紗篩廠；TU-1901型雙束光紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3方法

1.3.1粗子草提取物的定性反應(yīng)

1.3.1.1鹽酸鋅粉反應(yīng)[4]

移液管移取粗子草提取物置于錐形瓶中，加入少量Zn粉，滴加濃鹽酸4滴～5滴，震蕩后，觀察溶液變化。

1.3.1.2鋁鹽反應(yīng)[5]

向粗子草提取液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %Al（NO3）3溶液，觀察溶液的顏色變化。

1.3.1.3氨顯色反應(yīng)[5]

將粗子草乙醇提取液滴于濾紙上風(fēng)干，以揮發(fā)氨熏濾紙，觀察其顏色變化，再將濾紙?jiān)谕L(fēng)處放置久后，再觀察其顏色變化。

1.3.2蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[6-8]

黃酮類化合物在亞硝酸鈉做穩(wěn)定劑情況下，與硝酸鋁在堿性條件下作用生成黃色絡(luò)合物，呈黃色，可用紫外分光光度計(jì)測量黃酮類化合物的含量。精密稱取120℃減壓干燥至恒重，加入75 %乙醇溶解，定容至100 mL容量瓶中。分別取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，置于錐形瓶中，先加5%NaNO21mL，再加10%Al（NO3）31 mL，搖勻后放置6 min，再加入4 % NaOH 15 mL，搖勻后靜置20 min，加75 %乙醇定容至100 mL。

用第一個(gè)樣品做空白樣，在450 nm～800 nm范圍內(nèi)掃描其他樣品，如圖1所示，得掃描曲線，確定總黃酮的測量波長為510 nm。

在510 nm處，分別測出6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，并對吸光度與黃酮質(zhì)量濃度的關(guān)系作圖，如圖2示。通過線性回歸，得到質(zhì)量濃度與吸光度的關(guān)系：

C＝0.089 6A + 0.000 3，R2＝0.999 4

式中：A為吸光度；C為蘆丁的質(zhì)量濃度，mg/mL。

圖1蘆丁吸收峰掃描Fig.1 Rutin absorption wavelength scan

圖2蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Rutin standard curve

1.3.3粗子草總黃酮的提取及測定[9-10]

將粗子草用研缽研磨，過40目篩，準(zhǔn)確稱取一定量的研磨后的粗子草，用一定量的乙醇溶液在一定條件下浸提取一定時(shí)間，過濾，得黃色濾液，在100 mL容量瓶中定容。取2 mL濾液，按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法顯色，在510 nm處，用紫外-可見分光光度計(jì)測定其吸光度，質(zhì)量濃度由下式計(jì)算而得，C＝0.089 6A + 0.000 3

粗子草總黃酮得率的計(jì)算公式為：Y/（mg/g）＝（C× 50/2×100）/m

式中：Y為粗子草的得率，以1 g粗子草提取的總黃酮mg表示；C為粗子草總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；m為所用粗子草的質(zhì)量數(shù)，g。

2　結(jié)果與分析

2.1粗子草黃酮類物質(zhì)的定性分析

2.1.1鹽酸鋅粉反應(yīng)

經(jīng)過鹽酸鋅反應(yīng)后，溶液變成紫紅色。說明溶液中含有黃酮類化合物。因?yàn)辄S酮類的乙醇溶液在鹽酸存在的情況下，能被鋅粉還原，生成花色苷元從而呈現(xiàn)紅色或紫色反應(yīng)（個(gè)別為淡黃色、橙色、紫色或藍(lán)色）。

2.1.2鋁鹽反應(yīng)

跟鋁鹽在溶液中反應(yīng)后，溶液成黃褐色，說明有黃酮類物質(zhì)存在。因?yàn)辄S酮類化合物結(jié)構(gòu)中，凡具有C3-羥基、C4-羥基、C5-羥基、C4-羰基或鄰二酚羥基時(shí)，可以與許多金屬鹽類試劑如鋁鹽、鎂鹽等反應(yīng)，生成有色的絡(luò)合物，有的還產(chǎn)生熒光，因此可用于鑒別黃酮類化合物。

2.1.3氨顯色反應(yīng)

以揮發(fā)氨熏濾紙后，溶液立刻產(chǎn)生了深黃的顏色，當(dāng)濾紙放置久后，黃色消失。這是黃酮類化合物的典型反應(yīng)。在堿性條件下，二氫黃酮會(huì)轉(zhuǎn)化為查爾酮，呈黃綠色。

2.2粗子草總黃酮提取的單因素試驗(yàn)

2.2.1溶液體積分?jǐn)?shù)的影響

準(zhǔn)確稱取0.500 g研磨后的粗子草，按1∶30（g/mL）的比例本別加入無水乙醇40 %、50 %、60 %、70 %、80 %乙醇溶液，在溫度為60℃浸提120 min，測定并計(jì)算不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下粗子草的得率，得到乙醇體積分?jǐn)?shù)與總黃酮得率關(guān)系如圖3。

圖3溶劑的體積分?jǐn)?shù)對粗子草總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoid

如圖3所示，粗子草總黃酮得率先隨乙醇濃度的增大先增大后減小。當(dāng)乙醇濃度在60 %時(shí)，其得率最高；乙醇濃度大于60 %后，總黃酮得率隨乙醇濃度的增大而逐漸降低。這可能是因?yàn)橐掖紳舛冗^低時(shí)，總黃酮提取不完全；而乙醇濃度過高，導(dǎo)致脂溶性物質(zhì)溶出較多，影響總黃酮的溶出，因此確定60 %乙醇濃度為最佳條件。

2.2.2料液比的影響

準(zhǔn)確稱取0.500 g過40目的粗子草粉，按料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的比例加入60 %乙醇溶液，提取溫度為60℃，提取時(shí)間為120 min，測定并計(jì)算相應(yīng)條件下粗子草總黃酮的得率，得到料液比與粗子草總黃酮得率的關(guān)系如圖4所示。

從圖4中可以得出，在其它因素不變的情況下，粗子草總黃酮的得率隨所用溶劑用量的增加而增大，一般說來，在其他條件一定的情況下，物質(zhì)的溶解度一定，則總黃酮溶出量隨著提取溶劑的量增加而增加，但是，當(dāng)溶劑量達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，溶質(zhì)全部溶出，所以料液比繼續(xù)增加對得率的提升不明顯。確定1∶30（g/mL）為最佳提取料液比。

圖4料液比對粗子草總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the yield of flavonoid

2.2.3提取時(shí)間的影響

準(zhǔn)確稱取0.500 g過40目的粗子草，按料液比1∶30（g/mL）的比例加入60 %乙醇溶液，提取溫度為70℃，提取時(shí)間為30、60、90、120、150 min，測定并計(jì)算相應(yīng)條件下粗子草總黃酮的得率。提取時(shí)間與粗子草總黃酮得率的關(guān)系如圖5所示。

圖5提取時(shí)間對粗子草總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the yield of flavonoids

由圖5可知，粗子草總黃酮的得率隨著時(shí)間的增大而增大，但是當(dāng)時(shí)間達(dá)到90 min時(shí)，得率隨著時(shí)間的增加變化不明顯，說明總黃酮基本提取完畢，為了節(jié)省時(shí)間和降低能耗，確定90 min為最佳提取時(shí)間。

2.2.4提取溫度的影響

準(zhǔn)確稱量0.500 g過40目研磨后的粗子草，按1∶30（g/mL）的比例加入60 %乙醇溶液，提取溫度為40、50、60、70、80℃，提取時(shí)間為90 min，測定并計(jì)算相應(yīng)條件下粗子草總黃酮的得率。提取溫度與粗子草總黃酮得率關(guān)系如圖6所示。

由圖6可知，在其它條件不變的情況下，粗子草總黃酮的得率隨提取溫度的提高先增大后減小。提取溫度在60℃左右時(shí)，得率最高。之后隨著溫度的提高，得率反而下降。這可能是因溫度的提高，部分黃酮類化合物被氧化，同時(shí)，溫度升高，其他非黃酮類物質(zhì)的溶出增加，同樣會(huì)導(dǎo)致總黃酮得率降低。

圖6提取溫度對粗子草總黃酮得率的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on the yield of flavonoid

2.3粗子草總黃酮提取工藝的優(yōu)化

單因素試驗(yàn)表明，溶劑體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度對粗子草總黃酮得率均有影響。因此，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過L9（34）正交試驗(yàn)，進(jìn)一步研究它們的影響。

表1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Factor and level of orthogonal experiment and the result

由正交試驗(yàn)的結(jié)果可知，乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間以及溫度對粗子草總黃酮的得率均有顯著的影響，其中濃度，料液比，溫度影響及其顯著。影響的順序?yàn)椋禾崛囟龋疽掖紳舛龋玖弦罕龋咎崛r(shí)間。同時(shí)，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果可知，粗子草總黃酮最佳提取條件為：乙醇濃度為60 %，料液比為1∶30（g/mL），提取時(shí)間為90 min，提取溫度為60℃。驗(yàn)證此時(shí)總黃酮的得率為96.028 mg/g，高于正交試驗(yàn)各組組合的結(jié)果。

表2方差分析表Table 2 Analysis of variance table

3　結(jié)論

1）通過顏色試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，粗子草中存在黃酮類化合物。

2）乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間以及溫度對粗子草總黃酮的得率均有影響，影響的順序?yàn)椋禾崛囟龋疽掖紳舛龋玖弦罕龋咎崛r(shí)間；根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果可知，粗子草總黃酮最佳提取條件為：乙醇濃度為60 %，料液比為1∶30（g/mL），提取時(shí)間為90 min，提取溫度為60℃，此時(shí)總黃酮的得率為96.028 mg/g。

3）粗子草作為稀有的傘形科植物，可進(jìn)一步研究其揮發(fā)油和總多酚等功效成分。

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Study on the Extraction of Total Flavones from T.roylei

ZENG Di1，3，WANG Yu-Tao2，3，HUANG Qin1，LONG Wei1，ZHU Si-Ming1，*
（1. College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，Guangdong，China；2. Department of Biologic and Geographic Sciences，Kashgar University，Kashgar 844006，Xinjiang，China；3. Key Laboratory of Ecology and Biological Resources in Yarkand Oasis，Kashgar University，Kashgar 844006，Xinjiang，China）

Abstract：T.roylei is a rare medicinal umbelliferous plant，as tea drinking that can cope with altitude sickness and hypertension. The total flavones were extracted with alcohol as the solvent from T.roylei and the extract was analyzed qualitatively by means of color development reaction. The effects of the extraction conditions such as the concentration of ethanol，the ratio of T.roylei to solution of ethanol，the extraction time and extraction temperature were studied. The results showed that T.roylei was rich in flavonoids；the rate of T.roylei 's flavones effects in the order of extraction temperature，ethanol concentration，solid-liquid ratio，extraction time. The best extraction of T.roylei 's flavones was that The concentration of ethanol was 60 %，the ratio of T.roylei to solution of ethanol was 1∶30（g/mL），the extraction time was 90 min and the extraction temperature was 60℃. Research can provide a reference for medicinal T.roylei's protective development.

Key words：T.roylei；flavonoid；extraction

收稿日期：2015-06-21

*通信作者：朱思明（1976—），男（漢），教授，博士，研究方向：糖廠綜合利用研究。

作者簡介：曾諦（1991—），男（漢），碩士研究生在讀，研究方向：天然產(chǎn)物的提取。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（U1203183）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B020310006, 2014A020209019）；華南理工大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（2014ZZ0050）；新疆維吾爾族自治區(qū)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（201475002）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.014