楊秦，呂學遠，代鵬飛，余龍江，金文聞，*（.華中科技大學生命科學與技術(shù)學院，資源生物學與生物技術(shù)研究所，湖北武漢40074；2.華中師范大學體育學院，湖北武漢40079；.武漢華士特工業(yè)生物技術(shù)開發(fā)有限公司，湖北武漢40074）

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瑪咖石油醚提取物抗疲勞的影響及組分分析

楊秦1，2，呂學遠1，代鵬飛3，余龍江1，金文聞1，*
（1.華中科技大學生命科學與技術(shù)學院，資源生物學與生物技術(shù)研究所，湖北武漢430074；2.華中師范大學體育學院，湖北武漢430079；3.武漢華士特工業(yè)生物技術(shù)開發(fā)有限公司，湖北武漢430074）

摘要：利用長時間游泳制備小鼠運動疲勞模型，探討瑪咖石油醚提取物對抗運動性疲勞的功效及可能機制。結(jié)果顯示，補充瑪咖石油醚提取物可以顯著延長負重力竭游泳時間，顯著降低血乳酸、血氨和血乳酸脫氫酶，增加非酯化脂肪酸和肝糖原含量，而血尿素氮和血糖無顯著性差異。高效液相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜分析顯示瑪咖石油醚提取物含有脂肪酸和約20%瑪咖酰胺。

關(guān)鍵詞：瑪咖；石油醚提取物；抗疲勞；能量代謝

運動性疲勞是體內(nèi)一個復雜的生理生化變化過程，代謝失調(diào)能導致疲勞的產(chǎn)生[1]。代謝失調(diào)包括能源物質(zhì)的消耗如糖原和葡萄糖，以及代謝產(chǎn)物的積累如乳酸、尿素氮、氨等[2]。有很多方法可以緩解疲勞，而補充無毒副作用的天然活性物質(zhì)是營養(yǎng)學家、運動生理學家不斷尋找的緩解運動性疲勞的方法之一。

瑪咖（Lepidium meyenii Walp.），是一種藥食兩用植物，屬于十字花科，生長在3 500 m的高寒地區(qū)[3]。瑪咖具有很多藥理活性，如增加生育率、增強性欲、提高精力等。已有研究發(fā)現(xiàn)二氧化碳超臨界流萃取的瑪咖脂溶性物質(zhì)能顯著提高負重游泳小鼠的力竭游泳時間[4]。本試驗研究石油醚提取的瑪咖脂溶性成分抗運動性疲勞的功效及可能機制，并用高效液相色譜儀和氣相色譜-質(zhì)譜儀分析了石油醚提取物中的脂溶性成分，以期為抗疲勞天然產(chǎn)品的開發(fā)找到參考。

1　材料與方法

1.1試劑

瑪咖：麗江百歲坊生物科技開發(fā)有限公司；瑪咖酰胺標準品：武漢華士特工業(yè)生物技術(shù)開發(fā)有限公司；石油醚、甲醇、正己烷、吐溫-80、氯化鈉、氫氧化鉀、三氟化硼、乙醚：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、甲醇：色譜純，Tedia公司；血乳酸、血氨、血乳酸脫氫酶、非酯化脂肪酸、糖原、血尿素氮、血糖試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2實驗動物

Balb/c小鼠由湖北省實驗動物研究中心提供。5周齡雄性小鼠在動物飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)，室內(nèi)燈光12 h明暗交替，室溫為（23±1）℃。在試驗期間，所有小鼠允許自由攝取嚙齒類動物飼料和蒸餾水。

1.3儀器與設備

1200型高效液相色譜儀：安捷倫科技公司；5975C型氣相色譜-質(zhì)譜儀：安捷倫科技公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責任公司；SB-5200DT超聲波清洗儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-1600紫外分光光度儀：上海美譜達儀器有限公司；GL-21M高速冷凍離心機：湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司；三用電熱恒溫水箱：天津市泰斯特儀器有限公司；AE100分析天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；YP202N電子天平：上海精密科學儀器有限公司。

1.4方法

1.4.1瑪咖石油醚提取物的制備

瑪咖根被洗凈并切成薄片，干燥處理后，用粉碎機粉碎并過80目篩。干燥的瑪咖粉用12倍體積石油醚50℃磁力攪拌回流提取30 min，再超聲提取15 min，減壓抽濾得到上清液。再重復一次以上步驟，合并抽濾的上清液，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在48℃～52℃下真空濃縮。臨用前，將濃縮后的提取物用1 %吐溫-80超聲溶解，放于4℃冰箱備用。

1.4.2動物分組與給藥

小鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，適應性游泳10 min，淘汰不能游泳的小鼠，第4天進行負重5 %力竭游泳實驗，記錄力竭游泳時間，根據(jù)小鼠的游泳能力和體重進行分組。小鼠被分為3組，每組10只，分別是空白對照組、瑪咖石油醚提取物低劑量組（60 mg/kg·bw）和石油醚提取物高劑量組（200 mg/kg·bw）。實驗劑量的選擇根據(jù)前期預實驗結(jié)果設置。小鼠灌胃劑量為每天0.2 mL/10 g，連續(xù)灌胃21 d，空白對照組灌胃相同體積的溶媒。

1.4.3負重游泳能力測試

小鼠每周游泳2次，每次10 min，以習慣游泳。實驗第14天，小鼠灌胃30 min后進行負重游泳實驗，記錄力竭游泳時間。負重游泳實驗用來評估小鼠的耐力表現(xiàn)，實驗方法參照文獻[5]，略有改動。具體如下：灌胃30 min后，小鼠被放置到塑料池（80 cm×45 cm× 40 cm）中游泳，池水深度為35 cm，水溫為（27±1）℃。距離小鼠尾根部1 cm處負體重5 %的鉛皮。小鼠沉在水下10 s不能浮出水面用鼻子呼吸被認為達到力竭狀態(tài)，迅速將其撈起，并記錄力竭游泳時間。

1.4.4血液的采集及生化指標的測定

負重游泳實驗結(jié)束，小鼠繼續(xù)灌胃7 d，實驗第21天灌胃30 min后，小鼠游泳90 min。游泳結(jié)束后，立即拔除小鼠眼球，血液從眼球后的血管叢收集。血樣靜置半小時后，4℃下3 000 r/min離心10 min，取上清，并儲存在-80℃超低溫冰箱備用。血乳酸（LD）、血氨（BA）、血乳酸脫氫酶（LDH）、非酯化脂肪酸（NEFA）、肝糖原（LG）、血尿素氮（BUN）、血糖等指標用試劑盒進行測定。

1.4.5瑪咖石油醚提取物脂肪酸種類檢測

瑪咖石油醚提取物甲酯化后，用正己烷溶解。用氣相色譜-質(zhì)譜儀（GC-MS）分析樣品，色譜柱為HP-5MS柱（30 m×250 μm×0.25 μm，安捷倫科技公司）。進樣量為0.2 μL，流速為1 mL/min，檢測器溫度為230℃。升溫程序是160℃保持2 min，然后以4℃/min升溫到180℃保持4 min，然后以10℃/min升溫到300℃保持5 min。

1.4.6瑪咖石油醚提取物中瑪咖酰胺的含量分析

高效液相色譜（HPLC）分析參考McCollom等[6]研究方法略作改動，簡要如下：將瑪咖脂溶性成分溶于甲醇，過0.45 μm濾膜，色譜柱為TC-C18柱（250 mm× 4.6 mm×5 μm，安捷倫科技公司），流動相為90 %乙腈，流速為0.6 mL/min，進樣量為20 μL。檢測波長為210 nm，室溫下操作。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析處理，所有數(shù)據(jù)用平均值±標準偏差表示。數(shù)據(jù)用單因素方差分析，組間用LSD-t檢驗比較。P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01具有極顯著差異。

2　結(jié)果與分析

2.1對小鼠負重游泳力竭時間的影響

瑪咖石油醚提取物補充對小鼠力竭游泳時間的影響見圖1。

圖1瑪咖石油醚提取物補充對小鼠力竭游泳時間的影響Fig.1 Effects of maca-petroleum ether extract on the swimming time to exhaustion of weight-loaded mice

空白對照組、瑪咖石油醚提取物低濃度和高濃度補充組的力竭游泳時間分別是（8.92±1.15）、（12.15±2.78）、（14.16±4.89）min。低濃度和高濃度補充組的力竭游泳時間比對照組各增加了36 %和59 %，具有顯著性差異（P < 0.05）。

2.2對小鼠體重的影響

記錄實驗前體重（始重）、實驗第7天（中重）和第14天（終重）的體重?，斂兔烟崛∥飳π∈篌w重的影響見表1，與對照組相比，小鼠體重無顯著性差異。

表1瑪咖石油醚提取物補充對小鼠體重的影響Table 1 Effects of maca-petroleum ether extract on body weights in mice

2.3對血液指標和糖原含量的影響

瑪咖石油醚提取物對血清參數(shù)和糖原含量的影響見表2。

表2瑪咖石油醚提取物對血清參數(shù)和糖原的影響Table 2 Effect of maca-petroleum ether extract on serum parameters and glycogen storage in mice

與對照組比較，瑪咖石油醚提取物高低劑量組的肝糖原（LG）顯著增加（P < 0.05），非酯化脂肪酸（NEFA）濃度顯著降低（P < 0.05）。與對照組相比，瑪咖石油醚提取物高低劑量組血乳酸（LD）和血乳酸脫氫酶（LDH）活力顯著降低（P < 0.05），血氨（BA）濃度顯著降低（P < 0.05，P < 0.01）。然而血清尿素氮（BUN）和血糖（Glucose）含量各組間沒有顯著性差異。

2.4瑪咖石油醚提取物成分中脂肪酸種類的分析

瑪咖石油醚提取物中脂肪酸的種類用氣相色譜分析見圖2。

圖2瑪咖石油醚提取物的氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of maca-petroleum ether extract

由此得出瑪咖石油醚提取物包含的脂肪酸主要為亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸、油酸和硬脂酸等。

2.5石油醚提取物中瑪咖酰胺的種類和含量分析

石油醚提取物中瑪咖酰胺的高效液相色譜分析見圖3。

圖3瑪咖酰胺的高效液相色譜分析，檢測波長210 nmFig.3 High Performance Liquid chromatograms of macamides quantified at 210 nm

提取物中瑪咖酰胺與混標的保留時間進行比較，其各自含量用標準曲線方程進行計算。結(jié)果顯示瑪咖石油醚提取物含有約20 %瑪咖酰胺。其中含量較高的3種瑪咖酰胺分別是化合物1為N-芐基亞麻酰胺，占4.22 %；化合物2為N-芐基亞油酰胺，占4.59 %；化合物3為N-芐基棕櫚酰胺，占6.63 %。

3　結(jié)論與討論

負重游泳實驗是評估體力疲勞程度的經(jīng)典實驗方法。研究結(jié)果顯示，補充瑪咖石油醚提取物能顯著延長小鼠負重游泳時間，提示瑪咖石油醚提取物具有抗運動性疲勞效果。此外，瑪咖石油醚提取物中含有脂肪酸和20 %瑪咖酰胺，主要包含芐基棕櫚酰胺、芐基亞油酰胺和芐基亞麻酰胺。

身體的運動耐力依賴于包括糖原在內(nèi)的能源儲存和代謝產(chǎn)物的積累[7]。在運動過程中，糖原作為重要的能源物質(zhì)用于補充血糖的消耗，保持血糖在生理范圍內(nèi)。增加糖原的消耗與運動疲勞的產(chǎn)生有一定關(guān)聯(lián)[8]。另一方面，在運動中增加脂肪酸的利用，可以減少糖原的消耗，增加耐力運動表現(xiàn)[9]。非酯化脂肪酸含量的增加被認為是肌肉中脂肪代謝的增強的原因[10]。研究結(jié)果顯示灌胃石油醚提取物小鼠的肝糖原（LG）和非酯化脂肪酸（NEFA）含量較對照組顯著增加（P < 0.05），而血糖水平無明顯變化。該結(jié)果提示瑪咖石油醚提取物提高運動耐力可能是因為增加脂肪的利用而減少了糖原的消耗。乳酸等代謝產(chǎn)物的積累是引起機體疲勞的又一原因[11]。多余的乳酸會引起pH降低，從而抑制肌肉收縮。因此快速消除乳酸對于緩解運動疲勞具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)灌胃瑪咖石油醚提取物組比對照組的血乳酸含量顯著性降低（P <0.05），而乳酸是碳水化合物的代謝產(chǎn)物，乳酸含量的降低與葡萄糖和糖原的利用率降低結(jié)果一致。尿素氮（BUN）和氨（BA）是運動中蛋白質(zhì)和氨基酸降解的產(chǎn)物。研究結(jié)果顯示瑪咖石油醚提取物顯著降低BA濃度，而各組間的血清尿素氮（BUN）沒有顯著差異。血清乳酸脫氫酶（LDH）是肌肉損傷的指標，因為LDH通常存在于肌肉細胞中并作為肌肉損傷的結(jié)果被釋放到血液中[12]。研究結(jié)果顯示補充瑪咖石油醚提取物的小鼠比對照組的LDH活力更低，意味著補充瑪咖石油醚提取物能減輕運動中肌肉的損傷。

綜上結(jié)果，瑪咖石油醚提取物能延長小鼠負重游泳時間，對長時間運動小鼠能增加運動后肝糖原、非酯化脂肪酸含量，降低血乳酸、血氨、血乳酸脫氫酶水平，具有抗運動性疲勞的功效，且此功效可被部分解釋為通過轉(zhuǎn)變能量代謝實現(xiàn)的。

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Anti-fatigue Effect of Maca Petroleum Ether Extract and Its Component Analysis

YANG Qin1，2，Lü Xue-yuan1，DAI Peng-fei3，YU Long-jiang1，JIN Wen-wen1，*
（1. Institute of Resource Biology and Biotechnology，College of Life Science and Technology，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430074，Hubei，China；2. School of Physical Education and Sport，Central China Normal University，Wuhan 430079，Hubei，China；3. Wuhan Huashite Industrial Biotechnology Development Co.，Ltd.，Wuhan 430074，Hubei，China）

Abstract：This study investigated the effects of maca petroleum ether extract（MPE）on exercised-induced fatigue in mice to characterize its effective constituents and anti-fatigue mechanisms. Results suggested that supplementation with MPE could significantly extend the weight-loaded swimming time；reduce the serum lactic acid（LD），blood ammonia（BA），serum lactate dehydrogenase（LDH）；increase the non-esterified fatty acid（NEFA），liver glycogen（LG）levels；nevertheless，the levels of blood urea nitrogen（BUN）and glucose were not significantly different compared with the control group. High Performance Liquid Chromatography（HPLC）and Gas Chromatography-Mass Spectrometer（GC-MS）analysis showed that MPE contained about fatty acids and 20 % macamides.

Key words：maca；petroleum ether extract；anti-fatigue；energy metabolism

收稿日期：2015-04-13

*通信作者：金文聞（1976—），男（回），講師，博士，研究方向：天然產(chǎn)物化學研究與開發(fā)。

作者簡介：楊秦（1981—），女（侗），講師，博士在讀，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。

基金項目：國家基礎科學人才培養(yǎng)基金（Grant No.J1103514）；湖北省自然科學基金項目（No.2012FFB02607）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.003