鄭岳，孫偉，盧坤玲，鄭繼堯，王益民，李健( 秦皇島市第一醫(yī)院，河北秦皇島066000； 燕山大學(xué))

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·基礎(chǔ)研究·

龍葵多糖對(duì)四氯化碳致小鼠肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

鄭岳1，孫偉1，盧坤玲1，鄭繼堯1，王益民1，李健2(1 秦皇島市第一醫(yī)院，河北秦皇島066000；2 燕山大學(xué))

摘要：目的探討龍葵多糖對(duì)四氯化碳(CCl4)所致肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法選擇昆明種小鼠40只，隨機(jī)均分為百賽諾組、龍葵多糖低劑量組、龍葵多糖高劑量組、對(duì)照組、模型組。百賽諾組、龍葵多糖低劑量組、龍葵多糖高劑量組分別予百賽諾200 mg/kg、龍葵多糖200 mg/kg、龍葵多糖400 mg/kg灌胃，對(duì)照組、模型組給予等體積生理鹽水灌胃，均連續(xù)灌胃14天。末次灌胃1 h，對(duì)照組腹腔注射豆油溶液，其余四組腹腔注射含2% CCl4的豆油溶液。禁食12 h，龍葵多糖低劑量組、龍葵多糖高劑量組分別予龍葵多糖200、400 mg/kg灌胃，百賽諾組予百賽諾200 mg/kg灌胃，對(duì)照組和模型組予等體積生理鹽水灌胃。灌胃30 min，摘除眼球取血，檢測(cè)血清AST、ALT；斷頸處死小鼠，取肝臟，檢測(cè)肝臟指數(shù)及肝組織勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)。結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組肝臟指數(shù)增加(P<0.01)；龍葵多糖高劑量組及百賽諾組肝臟指數(shù)均較模型組降低(P均<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組血清AST、ALT水平均升高，肝組織勻漿SOD水平降低、MDA水平升高(P均<0.05)；與模型組比較，龍葵多糖低、高劑量組及百賽諾組血清AST、ALT水平均降低，肝組織勻漿SOD水平均升高，MDA水平均降低(P均<0.05)。結(jié)論龍葵多糖對(duì)CCl4所致的肝損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與增加肝組織抗氧化能力有關(guān)。

關(guān)鍵詞：肝損傷；龍葵多糖；四氯化碳；抗氧化作用；小鼠

龍葵全草及果實(shí)含有紅色素、氨基酸、維生素、多糖類(lèi)、生物堿類(lèi)等多種物質(zhì)[1~3]，具有清熱消腫、消炎止咳、抗腫瘤等作用[4]，目前已應(yīng)用于食品、染料、醫(yī)藥等領(lǐng)域[5]。研究表明，龍葵多糖主要通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，是一種免疫增強(qiáng)劑，通過(guò)提高抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化而發(fā)揮保護(hù)生物膜的作用[6]。但龍葵多糖是否具有肝保護(hù)作用，國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。2015年3~6月，本研究觀察了龍葵多糖對(duì)四氯化碳(CCl4)致小鼠肝損傷的保護(hù)作用，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料健康雄性昆明種小鼠40只，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。顆粒飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間自由攝食、飲水。龍葵多糖[制備：取干燥的龍葵全草，加入4倍體積水，微沸浸提5 h，過(guò)濾，濾渣重復(fù)提取3次，合并3次的水提液。靜置去沉淀后濃縮，逐漸加入95%乙醇(1∶4)并不斷攪拌，4 ℃靜置24 h。抽濾沉淀，分別用無(wú)水乙醇、丙酮、石油醚淋洗3次，得到淺黃色粉末狀物質(zhì)，干燥。將其溶于水中，加入等體積Savage液(氯仿∶正丁醇=4∶1)，振蕩、混勻、離心，棄下層有機(jī)相，重復(fù)上述操作10次，將游離蛋白除盡，保留上清液，干燥后稱(chēng)質(zhì)量。500 g龍葵全草經(jīng)過(guò)上述操作后得到龍葵粗多糖47.1 g(9.42%)]。AST、ALT試劑盒和MDA、SOD試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2動(dòng)物分組及處理所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為百賽諾組、龍葵多糖低劑量組、龍葵多糖高劑量組、對(duì)照組、模型組，每組8只。前三組分別予百賽諾200 mg/kg、龍葵多糖200 mg/kg、龍葵多糖400 mg/kg灌胃，后兩組予等體積生理鹽水灌胃，灌胃體積均為0.3 mL，均連續(xù)灌胃14天。末次灌胃1 h，對(duì)照組腹腔注射豆油溶液，其余四組腹腔注射含2% CCl4的豆油溶液，注射體積均為0.2 mL。禁食12 h，龍葵多糖低劑量組、龍葵多糖高劑量組分別予龍葵多糖200、400 mg/kg灌胃，百賽諾組予百賽諾200 mg/kg灌胃，對(duì)照組和模型組予等體積生理鹽水灌胃。

1.3相關(guān)指標(biāo)觀察①血清AST、ALT：灌胃30 min，摘除眼球取血，分離血清，采用AST、ALT試劑盒檢測(cè)血清AST、ALT。②肝臟指數(shù)：小鼠稱(chēng)質(zhì)量后斷頸處死，取出肝臟稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×1 000[5]。③肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)：肝臟組織勻漿，離心獲上清，制備成10%組織勻漿液，采用MDA、SOD試劑盒檢測(cè)MDA、SOD。

2結(jié)果

2.1各組血清ALT、AST水平比較見(jiàn)表1。

表1　各組血清ALT、AST水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與百賽諾組比較，△P<0.05。

2.2各組肝臟指數(shù)比較見(jiàn)表2。

表2　各組肝臟指數(shù)比較±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

2.3各組肝組織勻漿SOD、MDA比較見(jiàn)表3。

表3　各組肝組織勻漿SOD、MDA水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3討論

龍葵全草均可入藥，具有抗腫瘤、抑菌、抗病毒作用，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)疾病具有較好療效[7～10]。龍葵經(jīng)水提醇沉法可獲得水溶性多糖，即龍葵多糖。研究表明，龍葵多糖具有良好的抑瘤效果和免疫調(diào)節(jié)功能[11]，但其對(duì)肝損傷是否具有保護(hù)作用鮮見(jiàn)報(bào)道。

CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型是急性肝損傷研究的典型模型。目前認(rèn)為，CCl4引起肝細(xì)胞中毒與其自由基代謝產(chǎn)物導(dǎo)致機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)，其機(jī)制是CCl4經(jīng)肝細(xì)胞微粒體細(xì)胞色素P450氧化酶系統(tǒng)代謝、激活后生成三氯甲烷自由基、二氯甲烷自由基及過(guò)氧化三氯甲烷自由基，攻擊肝細(xì)胞膜或激活膜上的磷酸化酶，引起細(xì)胞膜和細(xì)胞器質(zhì)膜過(guò)氧化損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成發(fā)生障礙。CCl4誘發(fā)急性肝損傷的病理表現(xiàn)為肝細(xì)胞彌漫性變性、壞死、大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，與臨床病毒性肝炎病理變化極為相似。百賽諾(雙環(huán)醇片)可保護(hù)肝細(xì)胞膜和線粒體，減輕肝臟的炎性損傷，防止肝纖維化；可增強(qiáng)肝臟蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，可作為肝損傷陽(yáng)性對(duì)照藥物。

ALT和AST主要存在于肝細(xì)胞的胞質(zhì)和線粒體中，血清含量很低。血清ALT、AST水平可反映肝細(xì)胞膜損傷程度，是評(píng)價(jià)肝細(xì)胞壞死的重要指標(biāo)[12]。肝臟指數(shù)是反映肝細(xì)胞炎性病變的重要指標(biāo)，其水平與肝臟損傷程度呈正相關(guān)。肝損傷后細(xì)胞膜通透性增加，ALT、AST逸出細(xì)胞，導(dǎo)致血清ALT、AST升高。本研究結(jié)果顯示，模型組肝臟指數(shù)及血清AST、ALT水平均較對(duì)照組顯著升高。說(shuō)明小鼠急性肝損傷模型制備成功。

正常生理狀態(tài)生物體內(nèi)不斷生成自由基，機(jī)體可以通過(guò)自身的抗氧化酶系統(tǒng)進(jìn)行清除，不至于引起組織細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化而出現(xiàn)肝損傷。SOD是體內(nèi)代謝活性氧游離基的主要酶，其功能是將細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生的活性氧游離基代謝為過(guò)氧化氫，生成的過(guò)氧化氫在過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化酶的催化下分解為水，以消除自由基，阻止自由基的脂質(zhì)過(guò)氧化。CCl4誘發(fā)肝細(xì)胞產(chǎn)生的大量自由基可引起脂質(zhì)過(guò)氧化，產(chǎn)生大量脂質(zhì)過(guò)氧化物(LPO)，LPO進(jìn)一步氧化成終產(chǎn)物MDA。MDA含量可反映組織脂質(zhì)過(guò)氧化程度。本研究結(jié)果表明，龍葵多糖低、高劑量組肝臟指數(shù)及血清ALT、AST水平均較模型組降低，說(shuō)明龍葵多糖對(duì)急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，且效果與臨床常用保肝藥物百賽諾相近。龍葵多糖可以顯著增加肝損傷小鼠肝組織SOD活性，降低MDA水平，提示龍葵多糖可能通過(guò)增強(qiáng)肝細(xì)胞的抗氧化能力，維持細(xì)胞質(zhì)膜正常結(jié)構(gòu)，減輕肝組織損傷程度。

綜上所述，龍葵多糖對(duì)CCl4所致的急性肝損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與增加肝組織抗氧化能力有關(guān)。

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(收稿日期：2015-07-10)

中圖分類(lèi)號(hào)：R575.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)08-0023-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.08.008

通信作者：王益民(E-mail: drwangyimin@126.com)

基金項(xiàng)目：河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(14397702D)。