蘇瑋，魏萌，馮超，楊正江，陳心悅，程露陽，楊松鶴，喬躍兵,2

(1承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000;2滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校)

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·基礎(chǔ)研究·

CnIH側(cè)腦室注射后大鼠下丘腦組織中神經(jīng)肽Y mRNA及蛋白表達(dá)變化

蘇瑋1，魏萌1，馮超1，楊正江1，陳心悅1，程露陽1，楊松鶴1，喬躍兵1,2

(1承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000;2滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校)

摘要：目的觀察促性腺激素抑制激素(GnIH)側(cè)腦室注射后大鼠下丘腦組織中神經(jīng)肽Y(NPY)mRNA及蛋白表達(dá)變化。方法 雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各30只，分別給予側(cè)腦室注射GnIH(1 μg/μL,5 μL)和生理鹽水(5 μL)，分別于注射1、2、4 h后各處死10只，取下丘腦組織。采用real-time PCR法檢測(cè)NPY mRNA，免疫印跡法檢測(cè)NPY蛋白。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組注射后1、2、4 h下丘腦組織中NPY mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.759±0.025、1.755±0.219、2.671±0.696，NPY蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.225±0.015、0.244±0.015、0.264±0.009；對(duì)照組分別為0.633±0.021、0.568±0.006、0.631±0.015和0.113±0.004、0.125±0.007、0.128±0.011。兩組注射后2、4 h NPY mRNA表達(dá)量相比，P均<0.05；兩組注射后各時(shí)點(diǎn)NPY蛋白表達(dá)量比較，P均<0.05。結(jié)論 GnIH側(cè)腦室注射后，大鼠下丘腦組織中NPY mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)。

關(guān)鍵詞：促性腺激素抑制激素；神經(jīng)肽Y；下丘腦；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

促性腺激素抑制激素(GnIH)可通過一種新的G蛋白耦聯(lián)受體(GPR147)直接作用于垂體和下丘腦的促進(jìn)腺激素釋放激素(GnRH)神經(jīng)元，抑制促性腺激素釋放和合成[1]，減少黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)生成。GnIH還可能通過其他神經(jīng)元發(fā)揮調(diào)控生殖的作用，如神經(jīng)肽Y(NPY)。NPY神經(jīng)元主要位于下丘腦弓狀核[2]，在調(diào)控?cái)z食和能量平衡及生殖神經(jīng)內(nèi)分泌方面起重要作用。GnIH能夠抑制GnRH的釋放與合成，對(duì)于GnIH是否可通過NPY神經(jīng)元間接作用于GnRH尚不清楚。為此，我們觀察了GnIH側(cè)腦室注射后大鼠下丘腦組織中NPY mRNA及蛋白的表達(dá)變化。

1材料與方法

1.1動(dòng)物與材料健康成年雄性SD大鼠60只(北京華阜康生物科技股份有限公司)，分籠喂養(yǎng)，自由飲水，12 h/12 h循環(huán)光照。GnIH購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司；腦立體定位儀購(gòu)自日本Narishige公司；微量注射器購(gòu)自上海濟(jì)成分析儀器有限公司。

1.2動(dòng)物分組及GnIH側(cè)腦室注射方法60只大鼠適應(yīng)兩周后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各30只。兩組大鼠固定于腦立體定位儀上，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，頭頂備皮，碘酒消毒，縱向正中切開頭頂皮膚，暴露顱骨。根據(jù)《The Rat Brainin Stereotaxic Coordinates》第3版中的方法進(jìn)行側(cè)腦室定位。實(shí)驗(yàn)組注射GnIH(1 μg/μL，5 μL)，對(duì)照組注射生理鹽水(5 μL)，于5 min內(nèi)完成。分別于注射1、2、4 h 后，每小時(shí)組各取10只大鼠處死，迅速去除全腦，剝離下丘腦，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3大鼠下丘腦組織中NPY mRNA檢測(cè)取兩組下丘腦組織，提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)RNA濃度和純度后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。NPY mRNA上游引物序列為5′-TCCGCTCTGCGACACTACATC-3′，下游引物序列為5′-AAGGGTCTTCAAGCCTTGTTCTG-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度136 bp；內(nèi)參GAPDH mRNA上游引物序列為5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物序列為5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度143 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后分析對(duì)比灰度值。

1.4大鼠下丘腦組織中NPY蛋白檢測(cè)將下丘腦制成組織勻漿，冰上放置40 min，12 000 r/min 4 ℃離心20 min，取上清。用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。配12%分離膠、5%濃縮膠，SDS-PAGE分離的蛋白經(jīng)轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉4 ℃過夜，加入一抗(兔抗NPY多克隆抗體1∶1 000，鼠抗β-actin單抗1∶1 000)室溫孵育5 h，洗膜后加入二抗(羊抗兔IgG 1∶1 000，羊抗小鼠IgG 1∶1 000)，室溫孵育1 h，洗膜，化學(xué)發(fā)光顯影，定影，沖洗晾干備用。以Quantity One4.62軟件分析條帶平均灰度值，代表蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組注射后2、4 h下丘腦組織中NPY mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組(P均<0.05)；實(shí)驗(yàn)組注射后各時(shí)點(diǎn)NPY蛋白量表達(dá)高于對(duì)照組(P均<0.05)。詳見表1。

表1　兩組注射后不同時(shí)點(diǎn)下丘腦組織中NPY mRNA

注：與同時(shí)點(diǎn)對(duì)照組相比，*P<0.05。

3討論

下丘腦是調(diào)節(jié)攝食和能量平衡的中心[3]。動(dòng)物生殖功能與下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)密切相關(guān)，自然環(huán)境、社會(huì)因素及個(gè)體能量代謝狀態(tài)也會(huì)通過神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)作用于GnRH進(jìn)而影響HPG軸，一些神經(jīng)內(nèi)分泌因子可通過調(diào)節(jié)GnRH活性影響生殖功能。GnRH以脈沖方式分泌，是調(diào)控性腺活動(dòng)的關(guān)鍵因素。

GnIH是一種含有12個(gè)氨基酸的神經(jīng)肽，有廣泛的生物活性，以劑量依賴性抑制前垂體細(xì)胞分泌GnRH[1]。一項(xiàng)關(guān)于鳥類的研究表明，GnIH可作用于GnRH神經(jīng)元上的受體，抑制GnRH釋放[4]。大量哺乳動(dòng)物研究也發(fā)現(xiàn)，GnIH神經(jīng)纖維與GnRH神經(jīng)元有緊密接觸[5]。哺乳動(dòng)物GnIH同系物(RFRP)神經(jīng)元主要存在下丘腦背內(nèi)側(cè)核，該區(qū)域是調(diào)節(jié)食欲和能量平衡的中心，因此推測(cè)RFRP與攝食行為相關(guān)。GnIH促進(jìn)攝食作用在雄性大鼠和雌性大鼠研究中也得到證實(shí)[2,6,7]。有學(xué)者[8]發(fā)現(xiàn)羊的RFRP神經(jīng)元投射到NPY集中分布的大腦區(qū)域，推測(cè)GnIH與NPY存在一定聯(lián)系。

下丘腦GnRH的表達(dá)受多種內(nèi)源性因素影響，NPY是內(nèi)源性因子之一，其由下丘腦神經(jīng)元分泌與合成，廣泛存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，可調(diào)節(jié)性成熟和機(jī)體能量代謝[9，10]。目前研究[11]表明，NPY受體表達(dá)在GnRH神經(jīng)元上，并通過軸突與GnRH神經(jīng)元連接，因此推測(cè)GnIH還可能通過作用于下丘腦NPY神經(jīng)元發(fā)揮對(duì)下丘腦GnRH神經(jīng)元的調(diào)節(jié)作用。

本實(shí)驗(yàn)于大鼠側(cè)腦室微量注射GnIH，并于注射后1、2、4 h觀察GnIH對(duì)大鼠下丘腦組織中NPY mRNA及蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組NPY mRNA和蛋白表達(dá)明顯增多，提示側(cè)腦室注射GnIH后可能在一定時(shí)間內(nèi)對(duì)大鼠下丘腦NPY神經(jīng)元起到正反饋調(diào)節(jié)作用。注射GnIH后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，GnIH對(duì)NPY是否仍有促進(jìn)作用尚未明確，我們將在今后研究中加以驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)：

[1] Ukena K, Ubuka T, Tsutsui K. Distribution of a novel avian gonadotrophin-inhibitory hormone in the quail brain[J]. Cell Tissue Res, 2003,312(1):73-79.

[2] Tachibana T, Sato M, Takahashi H, et al. Gonadotrophin-inhibiting hormone stimulates feeding behavior in chicks[J]. Brain Res, 2005,1050(1-2):94-100.

[3] 龔雅婷,史小林,牛晶晶,等.下丘腦炎癥和肥胖發(fā)病機(jī)制[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2014,16(7):85-88.

[4] Tsutsui K. A new key neurohormone controlling reproduction, gonadotropin-inhibitory hormone(GnIH): Biosynthesis，mode of action and functional significance[J]. Prog Neurobiol, 2009,88(1):76-88．

[5] Clarke IJ, Qi Y, Puspita Sari I, et al. Evidence that RF-amide related peptides are inhibitors of reproduction in mammals[J]. Front Neuroendocrinol, 2009,30(3):371-378．

[6] Johnson MA, Tsutsui K, Fraley GS. Rat RFamide-related peptide-3 stimulates GH secretion, inhibits LH secretion，and has variable effects on sex behavior in the adult male rat [J]. Horm Behav, 2007,51(1):171-180．

[7] Murakami M, Matsuzak I, Iwasa TI, et al. Hypophysiotropic role of RFamide-related peptide-3 in the inhibition of LH secretion in female rats[J]. J Endocrinol, 2008,199(1):105-112．

[8] Qi Y, Oldfield BJ, Clarke IJ. Projections of RFamide-related peptide-3 neurones in the ovine hypothalamus,with special reference to regions regulating energy balance and reproduction[J]. J Neuroendocrinol, 2009,21(8):690-697．

[9] 倪迎冬,周玉傳,王亞菊,等.長(zhǎng)短日照下紹鴨性成熟時(shí)間、下丘腦GnRH-I、POMC和NPY mRNA表達(dá)的差異[J].動(dòng)物學(xué)研究,2005,26(5):539-544.

[10] Bi S, Kim YJ, Zheng F. Dorsomedial hypothalamic NPY and energy balance control[J]. Neuropeptides(Edinburgh), 2012,46(6):309-314.

[11] Fetissov SO, Kopp J, Hokfelt T. Distribution of NPY receptors in the hypothalamus[J]. Neuropeptides, 2004,38(4):175-188.

(收稿日期：2015-10-24)

中圖分類號(hào)：R322.81

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)07-0027-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.07.009

通信作者：?jiǎn)誊S兵(E-mail: chengll526@126.com)

基金項(xiàng)目：河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(p013406115)。