劉寶欣，劉英宇，魏中秋，梁婷婷，范玉磊，楊方，孫影

(1華北理工大學附屬唐山市工人醫(yī)院，唐山063000；2華北理工大學基礎醫(yī)學院)

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Prx-1基因沉默對TGF-β1誘導肺成纖維細胞增殖、ROS水平、p-AKT蛋白表達的影響

劉寶欣1，劉英宇1，魏中秋2，梁婷婷2，范玉磊2，楊方2，孫影2

(1華北理工大學附屬唐山市工人醫(yī)院，唐山063000；2華北理工大學基礎醫(yī)學院)

摘要：目的觀察硫氧還原蛋白過氧化物酶1(Prx-1)基因沉默對轉化生長因子β1(TGF-β1)誘導肺成纖維細胞增殖、活性氧簇(ROS)水平及磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表達的影響。方法 體外培養(yǎng)肺成纖維細胞MRC-5，并分為對照組、TGF-β1組、陰性轉染組和實驗組。陰性轉染組和實驗組分別通過脂質體Lipofectamine2000轉染陰性對照siRNA及設計好的3個Prx-1 siRNA(Prx-1 siRNA-209、Prx-1 siRNA-289、Prx-1 siRNA-453)，培養(yǎng)48 h，real-time PCR法檢測Prx-1 mRNA，選取轉染Prx-1 siRNA-453的細胞用于后續(xù)實驗。除對照組外，其余三組給予TGF-β1(5 μg/L)刺激。TGF-β1刺激24 h后，MTT實驗觀察細胞增殖情況，2,7-二氯熒光素二乙酸(DCFH-DA)實驗檢測ROS水平；TGF-β1刺激45min后，Western blotting法檢測p-AKT蛋白。結果對照組、TGF-β1組、陰性轉染組、實驗組OD值分別為0.56±0.07、0.81±0.10、0.88±0.18、1.16±0.18，ROS水平分別為2 922±291、4 348±484、4 660±375、5 415±436；實驗組細胞增殖情況及ROS水平與其余三組相比，P均<0.01；TGF-β1組、陰性轉染組與對照組相比，P均<0.01。對照組、TGF-β1組、陰性轉染組、實驗組細胞中p-AKT蛋白相對表達量分別為0.45±0.05、0.60±0.07、0.57±0.07、0.77±0.09；實驗組與其余三組相比，P均<0.01；TGF-β1組與對照組相比，P<0.01。結論 Prx-1基因沉默可增強TGF-β1對肺成纖維細胞的增殖誘導作用，上調細胞內ROS水平和p-AKT蛋白表達。

關鍵詞：肺成纖維細胞；硫氧還原蛋白過氧化物酶1；基因沉默；轉化生長因子β1；細胞增殖；活性氧簇；蛋白激酶B

肺成纖維細胞增殖是矽肺肺組織纖維化的重要原因之一，轉化生長因子β1(TGF-β1)對肺成纖維細胞增殖有重要的促進作用[1]。TGF-β1可上調活性氧簇(ROS)水平，并由此激活C-Jun蛋白激酶(JNK)、細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)等信號轉導通路，促進矽肺纖維化[2，3]。最近研究表明，ROS激活蛋白激酶B (AKT)信號轉導途徑在細胞增殖中也發(fā)揮重要作用[4，5]。硫氧還原蛋白過氧化物酶1(Prx-1)可快速有效清除ROS，并抑制ROS介導的信號轉導通路激活[6]。2015年1~7月，我們觀察了Prx-1基因沉默對TGF-β1誘導肺成纖維細胞增殖、ROS水平及磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表達的影響，為Prx-1用于矽肺治療提供實驗依據。

1材料與方法

1.1實驗材料人胚胎肺成纖維細胞MRC-5，TGF-β1，兔抗人AKT抗體，兔抗人總AKT(T-AKT)和p-AKT抗體，兔抗人Prx-1抗體，Prx-1 siRNA及Prx-1上、下游引物，SYBR+Tap混合劑和M-MLV逆轉錄試劑盒，MTT試劑盒，活性氧檢測試劑盒，酶聯(lián)免疫檢測儀，凝膠圖像分析儀。

1.2Prx-1基因沉默方法及Prx-1 mRNA檢測利用脂質體Lipofectamine2000將預先設計好的3個Prx-1 siRNA(Prx-1 siRNA-209、Prx-1 siRNA-289、Prx-1 siRNA-453)轉染MRC-5細胞，培養(yǎng)48 h。TRIzol提取細胞總RNA，定量后取0.5 μg RNA行逆轉錄。取1 μL cDNA進行real-time PCR擴增。PCR反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。PCR結果示3個Prx-1 siRNA不同程度地降低了Prx-1 mRNA表達水平，其中轉染Prx-1 siRNA-453者Prx-1表達水平最低，將Prx-1 siRNA-453用于后續(xù)實驗。

1.3細胞培養(yǎng)與分組MRC-5細胞接種于含5%血清的DMEM培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃條件下常規(guī)培養(yǎng)。將MRC-5細胞分為四組，待MRC-5細胞融合至80%后開始實驗。對照組給予0.4%血清繼續(xù)培養(yǎng)；TGF-β1組給予0.4%血清培養(yǎng)12 h，使其同步化，然后給予TGF-β1(5 μg/L)刺激；陰性轉染組加入脂質體Lipofectamine2000和陰性對照siRNA，孵育48 h后0.4%血清培養(yǎng)12 h，給予TGF-β1(5 μg/L)刺激；實驗組加入脂質體Lipofectamine2000和Prx-1 siRNA-453，孵育48 h后0.4%血清培養(yǎng)12 h，給予TGF-β1(5 μg/L)刺激。

1.4MRC-5細胞增殖觀察TGF-β1刺激24 h后(對照組于同一時間)棄培養(yǎng)液，每孔加入MTT 200 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄MTT，每孔加入DMSO 150 μL，搖床振蕩10 min，495 nm波長測定吸光度(OD)值，以OD值代表MRC-5細胞增殖情況。

1.5MRC-5細胞內ROS檢測采用2,7-二氯熒光素二乙酸(DCFH-DA)實驗檢測ROS。各組細胞TGF-β1刺激24 h后用0.25%胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，加入DCFH-DA(終濃度為10 μmol/L)，37 ℃孵育20 min，PBS洗3次，計數1×104個細胞，用熒光酶標儀在激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm下測定細胞熒光強度，反映細胞內ROS水平。

1.6MRC-5細胞中p-AKT蛋白檢測采用Western blotting法。各組細胞經TGF-β1刺激45 min后棄培養(yǎng)液，PBS洗滌。每組加入200 μL新鮮配制的細胞裂解液，冰上震蕩裂解30 min，收集裂解細胞，12 000 r/min 4 ℃離心15 min，收集上清，-70 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ钥捡R斯亮藍R-250染色測定蛋白濃度，以每孔20 μg上樣，電泳并轉膜。5%牛血清白蛋白37 ℃封閉1 h，T-AKT和p-AKT一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，BCIP/NBT顯色3 min。用Image J軟件進行灰度掃描及定量分析。以p-AKT與T-AKT灰度值之比作為p-AKT相對表達量。

2結果

2.1各組細胞增殖情況比較對照組、TGF-β1組、陰性轉染組、實驗組OD值分別為0.56±0.07、0.81±0.10、0.88±0.18、1.16±0.18；實驗組與其余三組相比，P均<0.01；TGF-β1組、陰性轉染組與對照組相比，P均<0.01。

2.2各組細胞內ROS水平比較對照組、TGF-β1組、陰性轉染組、實驗組ROS水平分別為2 922±291、4 348±484、4 660±375、5 415±436；實驗組與其余三組相比，P均<0.01；TGF-β1組、陰性轉染組與對照組相比，P均<0.01。

2.3各組細胞中p-AKT蛋白表達比較對照組、TGF-β1組、陰性轉染組、實驗組細胞中p-AKT蛋白相對表達量分別為0.45±0.05、0.60±0.07、0.57±0.07、0.77±0.09；實驗組與其余三組相比，P均<0.01；TGF-β1組與對照組相比，P<0.01。

3討論

ROS是細胞氧化系統(tǒng)中產生的含有活性氧功能基團的化合物，包括氧自由基、過氧化物和激發(fā)態(tài)氧等。病理狀態(tài)下，過多ROS攻擊細胞脂質、蛋白質和DNA導致細胞損傷[7]。ROS還參與細胞內信號轉導通路，作為TGF-β1等多種細胞因子的第二信使，調節(jié)ERK1/2、JNK等信號轉導途徑，介導細胞增殖[2，3]。最近研究顯示，ROS/AKT途徑參與了腫瘤細胞和平滑肌細胞的增殖[4，5]。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，當AKT被激活時，其第308位蘇氨酸和第473位絲氨酸發(fā)生磷酸化，并從細胞膜轉移到細胞質和細胞核，激活或抑制下游靶蛋白，進而發(fā)揮調節(jié)細胞增殖、凋亡等作用[8~10]。本研究實驗組在TGF-β1刺激24 h后，OD值較對照組增高，說明TGF-β1可誘導肺成纖維細胞增殖；同時TGF-β1組ROS水平及p-AKT表達較對照組增高，提示ROS/AKT通路激活在TGF-β1誘導的肺成纖維細胞增殖中發(fā)揮重要作用，與Wang等[11]的研究結果一致。

Prx-1是一種新型過氧化物酶，有強大的抗氧化能力，其結構中的過氧化半胱氨酸和可溶性半胱氨酸是清除H2O2的主要功能基團[12]。研究[13]顯示，Prx-1可通過降低ROS調節(jié)細胞的生物學活性。有學者[14]發(fā)現(xiàn)，Prx-1與NADPH氧化酶在人動脈粥樣硬化斑塊巨噬細胞中表達位置相同，表達水平呈正相關關系，認為Prx-1不僅可在ROS產生的第一時間原位將其清除，而且對ROS敏感度高，是氧化應激的“感受器” 。另外，Prx-1還可抑制ROS介導的細胞內信號轉導通路激活，如在β-拉帕醌(一種抗癌藥)誘導的人宮頸癌細胞凋亡過程中，凋亡信號調節(jié)激酶(ASK1)通過激活JNK途徑促進細胞凋亡，而Prx-1可通過促進TRX與ASK1結合從而抑制ASK1活性和細胞凋亡[15]。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Prx-1可下調ROS水平進而抑制JNK和ERK1/2通路激活，緩解大鼠矽肺纖維化[2，3，16 ]。本實驗利用Prx-1 siRNA轉染肺成纖維細胞，沉默Prx-1基因表達，結果顯示肺成纖維細胞增殖增強，ROS水平升高，p-AKT蛋白表達上調，提示Prx-1基因沉默后，ROS水平升高、AKT通路激活，二者在TGF-β1誘導的肺成纖維細胞增殖過程中發(fā)揮重要的促進作用。

結合上述研究結果，我們認為，Prx-1基因沉默可進一步增強TGF-β1對肺成纖維細胞的增殖誘導作用，上調細胞內ROS水平和p-AKT蛋白表達。

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Effects of silencing peroxiredoxin-1 gene on proliferation, ROS and p-AKT protein expression of pulmonary fibroblasts induced by TGF-β1

LIUBaoxin1,LIUYingyu,WEIZhongqiu,LIANGTingting,FANYulei,YANGFang,SUNYing

(1TangshanWorkers′HospitalAffiliatedtoNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of silencing peroxiredoxin-1 (Prx-1) gene on the proliferation, reactive oxygen species (ROS) and phosphorylated AKT (p-AKT) protein expression of pulmonary fibroblasts induced by TGF-β1. Methods The cultured MRC-5 pulmonary fibroblasts were randomly divided into 4 groups: control group, TGF-β1 group, negative transfection group and experimental group. The Prx-1 siRNA 3 sequences of Prx-1 siRNA (Prx-1 siRNA-209, Prx-1 siRNA-289, Prx-1 siRNA-453) were transfected into the negative transfection group and experimental group by Lipofectamine2000, respectively. After culturing for 48 h, Prx-1 mRNA was detected by real-time PCR to evaluate transfection and Prx-1 siRNA-453 was selected to be used later. Except for the control group, the other three groups were co-cultured with TGF-β1 (5 μg/L). Cell proliferation was detected by MTT assay and reactive oxygen species (ROS) level was detected by DCFH-DA assay after 24 h of TGF-β1 stimulation. p-AKT expression was detected by Western blotting after 45 min of TGF-β1 stimulation. Results The OD was respectively 0.56±0.07, 0.81±0.10, 0.88±0.18 and 1.16±0.18 in the control group, TGF-β1 group, negative transfection group and experimental group, and the levels of ROS were 2 922±291, 4 348±484, 4 660±375 and 5 415±436, respectively. Significant difference were found in the levels of ROS and OD between the experimental group and the other three groups (all P<0.01). The p-AKT expression of the control group, TGF-β1 group, negative transfection group and experimental group was 0.45±0.05, 0.60±0.07, 0.57±0.07 and 0.77±0.09, respectively. The expression of p-AKT in the experimental group was the highest in all groups (all P<0.01). The p-AKT expression of the TGF-β1 group was higher than that of the control group (P<0.01). Conclusion Silencing Prx-1 gene can enhance the proliferation of pulmonary fibroblasts induced by TGF-β1, and up-regulate the level of ROS and p-AKT protein expression in the cells.

Key words:lung fibroblasts; peroxiredoxin; gene Silencing; transforming growth factro-β1; cell proliferation; reactive oxygen species; protein kinase B

(收稿日期：2015-11-08)

中圖分類號：R563.9

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)07-0017-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.07.006

通信作者簡介：孫影(1976-)，女，博士，副教授，主要研究方向為矽肺的基礎研究。E-mail: 1565756268@qq.com

作者簡介：第一劉寶欣(1974-)，女，副主任醫(yī)師，主要研究方向為慢阻肺的基礎和臨床。E-mail: syzxp@sina.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81072254)；唐山市科學技術研究與發(fā)展項目(14130275B)。