安玉蘭，鄧麗君，孫 晴，靳生艷，李青紅，陳麗麗，黃寧慶，陸 川，程 蓉

(青海大學附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)科，西寧 810001)

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在糖尿病足創(chuàng)面皮膚的表達水平及其臨床意義※

安玉蘭，鄧麗君，孫 晴，靳生艷，李青紅，陳麗麗，黃寧慶，陸 川，程 蓉

(青海大學附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)科，西寧 810001)

目的 探討基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在糖尿病足創(chuàng)面皮膚的表達水平及其臨床意義。方法 免疫組織化學SP法檢測8例正常皮膚組織和9例糖尿病足患者創(chuàng)面組織中MMP-2、MMP-8、MMP-9表達水平；ELISA法檢測58例正常人和55例糖尿病足患者血清中MMP-2、MMP-8、MMP-9表達水平，分析其臨床意義。結(jié)果 MMP-2在正常皮膚組織和糖尿病足創(chuàng)面組織中的表達無明顯差異(P>0.05)，MMP-8在正常組織中的表達明顯高于糖尿病足患者，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，MMP-9在正常皮膚組織中的表達明顯低于糖尿病足創(chuàng)面組織。兩組樣本血清中MMP-2、MMP-8表達差異無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)，血清MMP-9在糖尿病足患者中的表達明顯高于正常人，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。結(jié)論 MMP-8、MMP-9在糖尿病足患者創(chuàng)面組織和血清中的表達明顯升高，MMP-8、MMP-9可能與糖尿病患者糖尿病足的愈合存在關(guān)聯(lián)。

糖尿病足 MMPs 表達

本研究通過免疫組織化學SP法檢測糖尿病足患者創(chuàng)面組織中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2、MMP-8、MMP-9)的表達水平、ELISA法檢測糖尿病足患者血清中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2、MMP-8、MMP-9)的表達水平，分析糖尿病足創(chuàng)面基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)表達特點。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集青海大學附屬醫(yī)院2013～2014年確診為糖尿病足的患者及正常人群作為對照組，糖尿病足患者55例，男30例，女25例，年齡48～66歲。對照組58例，男33例，女25例，年齡36～70歲。收集皮膚組織用中性甲醛固定、石蠟包埋，4 μm切片。糖尿病足患者及正常人過夜禁食10 h，清晨空腹抽取靜脈血10 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 試劑及儀器設(shè)備

MMPs抗體試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，二抗Sunpoly-HⅡ聚合物檢測試劑盒(上海太陽生物技術(shù)有限公司)，ELISA試劑盒(美國Genlab公司)，SP免疫組織化學試劑盒、ZLI-9032濃縮型DAB顯色試劑盒、DAB顯色增強劑(北京中杉生物科技有限公司)，山羊血清(天津市灝洋生物制品科技有限公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，Dh-cg300圖像分析系統(tǒng)(中國大恒集團有限公司)。

1.2.2 方法

將所有病理組織標本的石蠟塊連續(xù)切片，厚度約為4 μm，用APES防脫片膠處理的載玻片撈片后置于60 ℃的恒溫烤箱內(nèi)烘烤2 h以上，使組織標本與載玻片緊密黏附。組織切片經(jīng)脫臘處理后在0.01 mol/L的枸櫞酸鹽緩沖溶液中高溫高壓進行抗原修復，然后按SP三步法免疫組化染色試劑盒說明書提供的實驗步驟進行操作。加入的一抗?jié)舛染鶠?：300。

所有收集血液室溫靜置30 min，離心(2500r/min)15 min分離血清，取3 mL置于-70 ℃冰箱中保存，采用ELISA試劑盒測定血清MMP-2、MMP-8、MMP-9水平。

1.3 結(jié)果判定方法

在顯微鏡下，我們將細胞膜或細胞質(zhì)、細胞核中存在淺黃色—棕褐色顆粒者認定為脂聯(lián)素受體陽性，評分采用半定量方法。每個切片隨機觀察8個高倍視野(×400)，每個視野計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞所占百分比。脂聯(lián)素受體檢測評分：陽性細胞數(shù)<5%為0分，陽性細胞5%～25%為1分，陽性細胞≥25%～50%為2分，陽性細胞≥50%～75%為3分，陽性細胞≥75%為4分。按染色強度評分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項相加后判定級別，0～1分為-，2分為+，3～4分為++，﹥5分為+++。+～+++視為陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較行t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP-2在糖尿病足創(chuàng)面皮膚組織及正常皮膚組織中的表達水平

MMPs在糖尿病足創(chuàng)面皮膚組織胞質(zhì)均勻表達，呈棕黃色至棕褐色表達；在正常皮膚組織胞質(zhì)少量表達，呈淺黃色至棕黃色表達。MMP-2的表達見圖1。糖尿病足患者皮膚組織MMP-2免疫組化顯色反應強度比較結(jié)果見表1。正常皮膚組織中MMP-2的平均表達量為13.55±4.6，糖尿病足患者創(chuàng)面皮膚組織中MMP-2的平均表達量為15.75±2.3，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 MMP-8在糖尿病足創(chuàng)面皮膚組織及正常皮膚組織中的表達水平

MMP-8的表達見圖2。糖尿病足患者皮膚組織MMP-8免疫組化顯色反應強度比較結(jié)果見表1。正常皮膚組織中MMP-8的平均表達量為19.31±3.66，糖尿病足患者創(chuàng)面皮膚組織中MMP-8的平均表達量為15.71±2.51，正常皮膚組織中MMP-8的平均表達量明顯高于糖尿病足患者創(chuàng)面皮膚組織中的表達量，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 MMP-9在糖尿病足創(chuàng)面皮膚組織及正常皮膚組織中的表達水平

MMP-9的表達見圖3。糖尿病足患者皮膚組織MMP-9免疫組化顯色反應強度比較結(jié)果見表1。正常皮膚組織中MMP-9的平均表達量為11.29±1.92，糖尿病足患者創(chuàng)面皮膚組織中MMP-9的平均表達量為23.34±2.35，糖尿病足患者創(chuàng)面皮膚組織中的表達量明顯高于正常皮膚組織中MMP-8的平均表達量，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4 MMP-2、MMP-8、MMP-9在糖尿病足患者及正常人血清中的表達水平

MMP-2、MMP-8、MMP-9在糖尿病足患者及正常人血清中的表達水平見表2。

左圖：MMP-2免疫組化染色(100×，A、C為正常對照者皮膚組織，B、D為糖尿病足患者皮膚組織)
右圖：MMP-2免疫組化染色(400×，A、C為正常對照者皮膚組織，B、D為糖尿病足患者皮膚組織)

Figure 1 MMP-2 expression in the skin tissue of diabetic foot wound and the normal skin tissue(SP×100，SP×400)

Table 1 Immunohistochemical chromogenic Intensity comparison of soft tissue MMP-2、MMP-8、MMP-9 among diabete patients

左圖：MMP-8免疫組化染色(100×，A、C為正常對照者皮膚組織，B、D為糖尿病足患者皮膚組織)
右圖：MMP-8免疫組化染色(400×，A、C為正常對照者皮膚組織，B、D為糖尿病足患者皮膚組織)

Figure 2 MMP-8 expression in the skin tissue of diabetic foot wound and the normal skin tissue(SP×100，SP×400)

左圖：MMP-9免疫組化染色(100×，A、C為正常對照者皮膚組織，B、D為糖尿病足患者皮膚組織)右圖：MMP-9免疫組化染色(400×，A、C為正常對照者皮膚組織，B、D為糖尿病足患者皮膚組織)

Table 2 Comparision of serum MMP-2、MMP-8、MMP-9 expression level among diabete patientsannormal

3 討論

MMPs是一類含Zn2+的內(nèi)源性蛋白水解酶，MMPs能降解解除多糖以外的所有胸包外基質(zhì)成分。許多研究證實絲氨酸蛋白酶系統(tǒng)中的uPA和uPA受體，通過激活MMPs從而參與細胞外基質(zhì)(ECM)降解的過程，是腫瘤ECM降解的經(jīng)典模式(uPA-uPAR-MMPs)[1]。慢性創(chuàng)面及腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，關(guān)鍵因素即MMPs的過度表達影響新血管形成和膠原沉積過程，導致組織液化。研究表明糖尿病人群的15%患有糖尿病足，因此糖尿病足是糖尿病患者截肢(趾)的主要原因之一[2]。糖尿病足潰瘍是糖尿病的嚴重慢性并發(fā)癥之一，截肢率高達33%[3]，研究表明[4]，糖尿病足創(chuàng)面組織中MMP-2、MMP-9的表達水平增加，活性增強，使創(chuàng)面難以愈合?，F(xiàn)有的研究表明，胰島素樣生長因子1(1IGF-1)是一種結(jié)構(gòu)類似胰島素的多肽，其作用主要為促進生長發(fā)育、細胞內(nèi)葡萄糖的轉(zhuǎn)運及細胞分裂增殖，血糖過高能抑制其合成和釋放，糖尿病患者該多肽明顯減少。基底層和成纖維細胞缺乏IGF-1可能使糖尿病足潰瘍延遲愈合[5]。

基質(zhì)金屬蛋白酶能夠顯著的降解血管壁基底膜(主要作用成分為MMP-2和MMP-9)。平滑肌細胞主要位于血管壁的中膜層，基底膜包繞其周。平滑肌細胞收縮的可能原因是基底膜與平滑肌細胞接觸。平滑肌細胞因為基底膜被降解而從中膜向內(nèi)膜遷移并增殖，增加細胞外基質(zhì)，纖維組織增生，產(chǎn)生動脈硬化[6]。糖尿病患者動脈中MMP-9通過中性粒細胞和巨噬細胞表達增強，因這兩種細胞是主要的炎癥反應細胞，因此導致糖尿病足潰瘍延遲愈合[7]。MMP-2是MMPs的一種，目前研究較多，MMP-2在青壯年糖尿病(Ⅰ型)血清樣本中升高顯著，有可能是早期糖尿病腎病的標志物之一；研究還發(fā)現(xiàn)MMP-2在Ⅱ型糖尿病大血管病變過程中亦升高，與糖尿病患者動脈硬化的形成及斑塊易破裂有關(guān)[8]?？赡苁翘悄虿∑つw易受損傷及急性創(chuàng)面慢性化的重要原因之一。血清 MMP-9水平升高者罹患糖尿病足潰瘍的風險會增加約20倍，對于合并血管并發(fā)癥的患者有非常高的預防價值[9]。因此有必要進一步明確糖尿病足局部創(chuàng)面MMPs水平，以利于更進一步了解其發(fā)病機制，并進一步地提出針對性的治療方案。

本研究通過免疫組織化學SP法及ELISA法檢測MMP-2、MMP-8、MMP-9的表達水平，結(jié)果表明MMP-2在正常皮膚組織和糖尿病足創(chuàng)面組織中的表達無明顯差異，此結(jié)果與其他研究結(jié)果之間存在差異的原因尚需進一步研究分析確定。我們分析認為，這與患者TIMPs濃度水平之間存在一定的相關(guān)性，在生理狀態(tài)下MMPs與TIMPs之間保持著動態(tài)平衡，協(xié)調(diào)ECM降解與重建，維持組織結(jié)構(gòu)的完整和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定；一般傷口在愈合過程中清除壞死物、細胞遷移和細胞外基質(zhì)降解重塑等過程中起著重要作用的是MMPs/TIMPs[10〗[11]。根據(jù)相關(guān)研究報道，創(chuàng)面的早期修復階段所發(fā)生的炎癥反應，包括上皮細胞的遷移、增殖是一致的，這表明炎癥細胞存放MMP-9和TIMP-1與角質(zhì)形成細胞的遷移的早期相關(guān)聯(lián)。因為MMP-9/TIMP-1的比值是動態(tài)平衡的，故提示正常人在MMPs發(fā)生變化的同時其生理性拮抗劑也發(fā)生著動態(tài)變化，這種動態(tài)平衡能夠防止局部組織過度破壞以及過量堆積，同時也有益于傷口的自我修復[12]。此推斷需要進一步的實驗研究印證。與其他研究結(jié)果類似，MMP-8在正常組織中的表達明顯高于糖尿病足患者，MMP-9在糖尿病足創(chuàng)面組織中的表達明顯高于正常皮膚組織，且與血清MMP-9濃度的增高程度存在對應關(guān)系。而正常人和糖尿病足患者血清中MMP-2和MMP-8的表達無差異，此結(jié)果需要對更大量的樣本進行檢測來進一步證實。血清MMP-9在糖尿病足患者中的表達明顯高于正常人，與李志紅[13]等人的研究具有一致性：MMP-8、MMP-9參與了糖尿病足潰瘍的形成[14]。

綜上所述，MMP-9在糖尿病足患者血清和創(chuàng)面組織中的表達明顯升高，MMP-9可能與糖尿病患者糖尿病足的愈合，其作用機制有待進一步研究。我們的研究由于樣本量較小，難免出現(xiàn)偏倚，有待進一步研究證實。

[1]焦鑫，譚志軍，孫浩，等.脂聯(lián)素受體表達與Ⅱ、Ⅲ期結(jié)腸癌患者術(shù)后輔助化療愈后的關(guān)系[J].腫瘤防治研究，2013，40(6)：580-583.

[2]李志紅，楊穎，郄濤.糖尿病足患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶水平變化[J].微循環(huán)學雜志，2013，23(4)：48-50.

[3]Gulam-Abbas Z，Lutale JK，Morbach S.Clinical outcome of diabetes patients hospitalized with foot ulcers，Dares Salaam，Tanzania[J].Diabet Med，2002，19(7)：575-9.

[4]張正軍，肖正華，陳定宇，等.黃氏多糖對糖尿病足潰瘍滲出液成纖維細胞MMP-2、MMP-9表達的影響[J].中國糖尿病雜志，2007，15(4)：202-203.

[5]廖二元，莫朝輝.內(nèi)分泌學[M].第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：1505-1515.

[6]劉曉紅.羅格列酮對2型糖尿病合并冠心病患者血清基質(zhì)金屬酶29及高敏C-反應蛋白的影響[J].中華實用診斷與治療雜志，2009，23(1)：12-14.

[7]Yu Liu，Danqing Min，Thyra Bolton，et al.Increased Matrix Matallopro-teinase-9 Predicts Poor Wound Healing in Diabetic Foot Ulcers[J].Dia-Care，2009，32：117-119.

[8]Rizzardi A E，Johnson A T，Vogel R I，et al.Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring[J].Diagn Pathol，2012，7(42)：1596-7.

[9]劉曉紅.羅格列酮對2型糖尿病合并冠心病患者血清基質(zhì)金屬酶29及高敏C-反應蛋白的影響[J].中華實用診斷與治療雜志，2009，23(1)：12-14.

[10]LobmannR，AmbroschA，SchultzG，et al.Expression of matrix- metalloproteinases and their inhibitors in the wounds of diabeticandnon-diabeticpatients[J].Diabe-tologia，2002，45(7)：1011-1016.

[11]朱平，嚴勵，陳黎紅，等.MMP-9/TIMP-1表達在糖尿病鼠皮膚傷口愈合過程中的變化及意義初探[J].中國病理生理雜志，2008，24(11)：2204-2208.

[12〗LobmannR，AmbroschA，SchultzG，et al.Expression of matrix- metalloproteinases and their inhibitors in the wounds of diabeticandnon-diabeticpatients[J].Diabe-tologia，2002，45(7)：1011-1016.

[13]李志紅，房輝，張云良，等.血清基質(zhì)金屬蛋白酶9、糖基化終產(chǎn)物與糖尿病的相關(guān)性研究[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志，2010，26(12)：1062.

[14]Herszenyi L，Hritz I，Pregun I，et al.Alterations of glutathionestransferase and matrix metalloproteinase-9 expressions are earlyevents in esophageal carcinogenesis[J].World J Gastroenterol，2007，13( 5)：676-682.

Matrix metalloproteinases(MMPs)expression level in the skin of diabetic foot wound and its clinical significance※

An Yulan，Deng Lijun，Sun Qing，Jin Shengyan，Li Qinghong，Chen Lili，Huang Ningqing，Lu Chuan，Cheng Rong

(Department of Joints，Qinghai University Affiliated Hospital，Xining，Qinghai 810001)

Objective To study the effects of matrix metalloproteinases(MMPs)expression level in the skin of diabetic foot wound and its clinical significance.Methods Used immunohistochemical SP method to detect MMP-2，MMP-8 and MMP-9 expression level in the 8 cases of normal skin and 9 patients with diabetic foot wound tissue.ELISA method was used to detect the serum levels of MMP-2，MMP-8 and MMP-9 in 58 cases of normal people and 55 patients with diabetic foot and analyze its clinical significance.Results MMP-2 showed no significant difference(P>0.05)in normal and diabetic foot wound tissue of the skin.MMP-8 expression is significantly higher than that in normal tissue in patients with diabetic foot (P<0.05)；MMP-9 was lower in normal skin tissue than that in the diabetic foot wound tissue.There was no obvious statistical significance difference(P>0.05)in both groups′ serum MMP-2 and MMP-8；the serum levels of MMP-9 expression in patients with diabetic foot was significantly higher than that in control group(P<0.001).Conclusion The tissue and serum expression level of MMP-8 and MMP-9 in patients with diabetic foot is significantly increased.It is suggested that both of them may be associated with the occurrence of diabetic foot in patients with diabetes.

Diabetic foot MMPs expression

R587.2

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.02.007

2015-12-12

※：青海大學附屬醫(yī)院中青年科研項目(ASRF-2013-16) 安玉蘭(1967～)，漢族，青海籍