謝 輝，于曉濤，李 君，張愛(ài)萍，魏柏青

(青海省地方病預(yù)防控制所鼠疫預(yù)防控制科，811602 西寧)

膠體金在不同培養(yǎng)溫度鼠疫FI抗原檢測(cè)中遇到的問(wèn)題※

謝 輝，于曉濤，李 君，張愛(ài)萍，魏柏青※※

(青海省地方病預(yù)防控制所鼠疫預(yù)防控制科，811602 西寧)

目的 對(duì)比膠體金紙上色譜試驗(yàn)(RGICA)、反向血凝試驗(yàn)(RIHA)及細(xì)菌檢驗(yàn)對(duì)于28 ℃與37 ℃鼠疫菌的敏感性及特異性。方法 28 ℃、37 ℃鼠疫菌培養(yǎng)24 h制備菌液與28 ℃、37 ℃的鼠疫菌感染臟器取材制成的菌懸液分別行反向血凝試驗(yàn)，細(xì)菌檢驗(yàn)及膠體金紙上色譜試驗(yàn)。結(jié)果 37 ℃鼠疫菌懸液及37 ℃鼠疫菌感染動(dòng)物制備菌懸液，膠體金、反向血凝試驗(yàn)及細(xì)菌檢驗(yàn)均敏感，28 ℃及28 ℃鼠疫菌感染動(dòng)物取材制備的菌懸液反向血凝試驗(yàn)、細(xì)菌檢驗(yàn)敏感，膠體金不敏感。結(jié)論 在現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用與鼠疫監(jiān)測(cè)中反向血凝試驗(yàn)因其具有簡(jiǎn)便、快速、敏感已被列入標(biāo)準(zhǔn)，28 ℃鼠疫菌膠體金檢測(cè)敏感性差，檢測(cè)FI抗原缺乏的鼠疫菌株易漏診，只能作為輔助診斷。

膠體金 溫度 鼠疫 抗原 檢測(cè) 問(wèn)題

鼠疫檢測(cè)通常是細(xì)菌學(xué)方法與血清學(xué)方法聯(lián)合使用，鼠疫的診斷主要依據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)和反向血凝試驗(yàn)。隨著免疫膠體金技術(shù)日益成熟，免疫膠體金出現(xiàn)取代ELISA等傳統(tǒng)檢測(cè)方法的趨勢(shì)。但在具體工作中我們發(fā)現(xiàn)，膠體金技術(shù)在檢測(cè)野外自斃動(dòng)物材料時(shí)存在不足，例如在2012年玉樹(shù)地震災(zāi)區(qū)開(kāi)展鼠疫防控監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)鼠疫菌培養(yǎng)試驗(yàn)及反向血凝試驗(yàn)陽(yáng)性，而鼠疫膠體金檢測(cè)FI抗原呈陰性。對(duì)此我們開(kāi)展了相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

EV76標(biāo)準(zhǔn)株由青海省地方病預(yù)防控制所菌種專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由青海省地方病預(yù)防控制所動(dòng)物中心提供；鼠疫FI抗原致敏血球(2012-1)、赫氏培養(yǎng)基(2012-1)由青海省地方病預(yù)防控制所自行生產(chǎn)；鼠疫抗原膠體金試劑盒(2012120509)由北京莊迪浩禾生物醫(yī)學(xué)科技有限公司生產(chǎn)；細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)比濁管由北京生物藥品檢定所提供。

1.2 方法

用28 ℃和37 ℃的細(xì)菌菌液分別行反向血凝試驗(yàn)、分離細(xì)菌檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)及膠體金紙上色譜試驗(yàn)，用28 ℃和37 ℃的細(xì)菌攻毒，攻毒后動(dòng)物取材分別行反向血凝試驗(yàn)、分離細(xì)菌檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)及膠體金紙上色譜試驗(yàn)。

1.2.1 取EV76標(biāo)準(zhǔn)株接種于0.1%溶血赫氏瓊脂培養(yǎng)基，分別置于28 ℃、37 ℃溫箱，培養(yǎng)24～48 h，用滅菌鹽水沖洗培養(yǎng)物制成菌懸液，用標(biāo)準(zhǔn)比濁管稀釋菌懸液(10億/mL)，分別行細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和鼠疫反向血凝試驗(yàn)(RIHA)、鼠疫膠體金紙上色譜試驗(yàn)(RGICA)平行檢測(cè)。

1.2.2 將上述兩種培養(yǎng)物制成菌懸液(10億/mL)，菌懸液接種小白鼠腹股溝皮下(5只，每只0.5mL)行感染，觀察3～5 d，處死動(dòng)物，取肝脾壓印0.1%溶血赫氏瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)各取肝脾1 g研磨加鹽水制成1：10臟器懸液行鼠疫反向血凝試驗(yàn)(RIHA)、鼠疫膠體金抗原實(shí)驗(yàn)(RGICA)平行檢測(cè)，以生理鹽水與未感染細(xì)菌動(dòng)物臟器作為空白對(duì)照。

1.2.3 將制備菌懸液和臟器懸液用生理鹽水按1：10稀釋后，吸取150 μL滴入F1抗原膠體金試紙條內(nèi)，5 min后可觀察到結(jié)果，20 min時(shí)終止觀察，結(jié)果可見(jiàn)兩條紫紅色線條，C線(質(zhì)控帶)和T線(反應(yīng)帶)皆顯色，結(jié)果為鼠疫抗原檢測(cè)陽(yáng)性；僅見(jiàn)一條紫紅色線條，結(jié)果為鼠疫抗原檢測(cè)陰性；無(wú)任何線條出現(xiàn)或僅有T線，說(shuō)明試驗(yàn)無(wú)效，重新測(cè)試，同時(shí)做空白對(duì)照。

1.2.4 鼠疫反向血凝試驗(yàn)與細(xì)菌培養(yǎng)按《鼠疫診斷標(biāo)準(zhǔn)》[1]進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 37 ℃細(xì)菌菌液與37 ℃臟器懸液經(jīng)RIHA、RGICA和細(xì)菌培養(yǎng)這三種方法同步檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性率為100%。

2.2 28 ℃細(xì)菌菌液與28 ℃臟器懸液用RIHA和細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性率為100%，RGICA檢測(cè)結(jié)果為陰性，見(jiàn)表1。

表1 鼠疫RIHA、RGICA和細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)比較結(jié)果

Table 1 Comparison of detecting Yersinia pestis with RIHA，bacteriology and RGICA

2.3 28 ℃和37 ℃菌液及臟器懸液的反向血凝結(jié)果見(jiàn)表2

表2 RIHA測(cè)定鼠疫抗原結(jié)果

Table 2 The results of detecting Yersinia pestis antigen with RIHA

3 討論

3.1 試驗(yàn)結(jié)果表明，將37 ℃的菌懸液及37 ℃的細(xì)菌感染動(dòng)物取材行RGICA、RIHA和細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，陽(yáng)性率均為100%，說(shuō)明這三種方法對(duì)檢測(cè)37 ℃細(xì)菌敏感。FI抗原為莢膜抗原，在37 ℃條件下鼠疫菌F1抗原含量高，現(xiàn)有資料表明莢膜抗原具有抗吞噬作用，感染動(dòng)物后，37 ℃細(xì)菌因具有FI抗原表現(xiàn)為促巨噬細(xì)胞使捕獲細(xì)菌能力減弱，致動(dòng)物死亡，死亡動(dòng)物臟器組織FI抗原含量高，由于小白鼠的平均體溫為35.2 ℃～36 ℃，適宜FI抗原的產(chǎn)生。因此，鼠疫菌在動(dòng)物體內(nèi)FI抗原產(chǎn)量高，所有特異檢測(cè)FI抗原的方法皆能檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果。

3.2 28 ℃菌懸液鼠疫抗原膠體金檢測(cè)陽(yáng)性率為100%。用28 ℃細(xì)菌菌懸液感染動(dòng)物，取材，經(jīng)鼠疫抗原膠體金檢測(cè)呈陰性，反向血凝試驗(yàn)陽(yáng)性率為100%，細(xì)菌檢測(cè)陽(yáng)性率為100%。28 ℃細(xì)菌含有少量FI抗原，膠體金色譜試驗(yàn)依然能檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果；28 ℃細(xì)菌感染動(dòng)物后，動(dòng)物發(fā)病死亡取材經(jīng)膠體金色譜試驗(yàn)不能檢測(cè)出鼠疫FI抗原，我們對(duì)于鼠疫菌進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，主要在什么部位繁殖，在動(dòng)物體內(nèi)如何代謝，所知甚少[2]。因此，對(duì)于同一株菌感染動(dòng)物后檢測(cè)結(jié)果不同，可能僅因培養(yǎng)溫度不同，即在28 ℃培養(yǎng)的細(xì)菌感染小白鼠，由于缺乏FI抗原，細(xì)菌對(duì)巨噬細(xì)胞的防御性降低，很容易被白鼠的巨噬細(xì)胞消化，因此在體內(nèi)孵育無(wú)法產(chǎn)生FI抗原[3]。本研究結(jié)果表明，28 ℃鼠疫菌FI抗原含量少，感染動(dòng)物后FI抗原含量依然少，值得檢驗(yàn)人員注意的是野外現(xiàn)場(chǎng)取材后，按四步檢驗(yàn)法，培養(yǎng)物均置于28 ℃溫箱，如遇FI抗原缺失的細(xì)菌，在細(xì)菌難以分離的情況下，膠體金無(wú)法測(cè)得，容易漏診。反向血凝試驗(yàn)由于致敏血球制備中抗體是通過(guò)全菌免疫自然產(chǎn)生的抗體即“多克隆”抗體，故可檢測(cè)到50種鼠疫菌毒力相關(guān)蛋白[4-5]，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白印跡兩種方法，對(duì)鼠疫FI抗體組分進(jìn)行分析，多克隆抗體除免疫球蛋白輕、重鏈之外，還有一些其他蛋白，約占總蛋白的60%[6]，鼠疫EV菌具有復(fù)雜的抗原成分，在感染和免疫方面鼠疫菌許多抗原特定部位中，F(xiàn)I抗原屬于被膜或外膜抗原，對(duì)這種抗原的性質(zhì)和特點(diǎn)做過(guò)較充分的研究，但其他部位的抗原及相應(yīng)抗體研究較少。有試驗(yàn)表明，將鼠疫菌的標(biāo)準(zhǔn)株的抗原，通過(guò)印跡反應(yīng)檢測(cè)鼠疫菌的全膜蛋白電泳后轉(zhuǎn)膜分別與FI的3種抗體結(jié)合的實(shí)驗(yàn)均出現(xiàn)了交叉反應(yīng)[7]，可以推測(cè)在野外檢測(cè)材料中存在多種鼠疫抗原，交叉反應(yīng)的出現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了用常規(guī)方法獲得的FI抗體特異性不高。由于制備抗體的免疫原為全菌免疫的抗血清，應(yīng)有其他免疫蛋白，反向血凝試驗(yàn)?zāi)軌蛟趧?dòng)物感染材料中檢出含量低的鼠疫FI抗原。RIHA測(cè)定鼠疫抗原結(jié)果表明，28 ℃鼠疫菌雖然缺失FI抗原，但RIHA依然能夠檢出，其滴度與37 ℃的細(xì)菌感染動(dòng)物后取材檢測(cè)RIHA滴度只低一個(gè)滴度，這也證明應(yīng)用多克隆抗體可以檢測(cè)相應(yīng)的多種鼠疫抗原。

3.3 從實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果及現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用來(lái)看，鼠疫抗原膠體金試驗(yàn)最主要的問(wèn)題是漏檢，漏檢的主要原因除上述FI抗原缺乏的問(wèn)題外，還存在試劑和樣本問(wèn)題。試劑的靈敏度限制膠體金檢測(cè)方法的靈敏度，膠體金試劑的靈敏度為10 ng/mL，當(dāng)檢測(cè)量低于10 ng/mL時(shí)，就容易出現(xiàn)假陰性。樣本的原因是由于被檢物抗原含量過(guò)高時(shí)，膠體金法全部不顯現(xiàn)陽(yáng)性條帶，出現(xiàn)“前置現(xiàn)象”，將被檢物稀釋后 ，陽(yáng)性條帶可立即顯現(xiàn)，該現(xiàn)象是由于樣本抗原濃度明顯多于膠體金制備濃度造成比例不適引起[8]。因此，在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中遇到可疑條帶不能判斷時(shí)，首先應(yīng)稀釋樣本，建議用不同濃度同時(shí)檢測(cè)避免漏診。

鼠疫是一種傳播迅猛亟需快速診斷判定的傳染病，因此鼠疫的早期診斷與鼠疫菌的快速鑒定對(duì)于鼠疫的防御與治療具有重要的意義。以往鼠疫的診斷主要依靠病原菌的分離，這往往受被檢材料的腐敗程度、取材前患者是否服用過(guò)抗生素、病原菌的毒力差異等因素影響，而且鼠疫菌的分離需要時(shí)間，因此僅僅靠細(xì)菌學(xué)診斷是不能滿足鼠疫疫源檢索、疫情監(jiān)測(cè)、動(dòng)物鼠疫調(diào)查、鼠疫患者診斷早期的需要及現(xiàn)場(chǎng)迅速判定的要求；RGICA采用鼠疫單克隆抗體作為捕捉抗原的探針，捕捉特異的FI抗原具有較強(qiáng)的特異性，由于操作簡(jiǎn)便、快速，已被檢驗(yàn)人員廣泛使用，但其敏感性不高，在實(shí)際工作中有局限，只能用于初篩檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果不能作為確診依據(jù)；反向凝集試驗(yàn)檢測(cè)快、敏感度高，在鼠疫疫情判定和疫源地追溯診斷中依然是經(jīng)典的檢測(cè)方法。

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Explore the problems of colloidal gold paper chromatography in plague FI antigen detection

Xie Hui，Yu Xiaotao，Li Jun，Zhang Aiping，Wei Baiqing

(Qinghai Province Institute of Endemic Disease Prevention and Control，Xining 811602)

Objective Compared the specificity and sensitivity of colloidal gold paper chromatography(RGICA)，reverse indirect hemagglutination assay(RIHA)and bacteria inspection for Yersinia pestis which were cultured at 28 ℃ and 37 ℃，respectively.Methods Yersinia pestis were cultivated 24 h at 28 ℃ and 37 ℃ to prepare with bacteria liquid and infected animals preparation of bacteria suspension and then were respectively performed RGICA，RIHA and bacteria inspection.Results RGICA，RIHA and bacteria inspection were sensitive in 37 ℃ plague bacteria liquid and 37 ℃ plague bacteria infected animals prepared with bacteria suspension.RGICA，RIHA and bacteria inspection were not sensitive in 28 ℃ plague bacteria liquid and 28 ℃ plague bacteria infected animal prepared with bacteria suspension.Conclusion Because of its simple，rapid and sensitive characteristics，RIHA has been used as a diagnostic criteria for plague.the sensitivity of 28 ℃ colloidal gold paper is poor and the absence of f1-negative strains antigen detection may lead to misdiagnosis，it can only be used as a auxiliary diagnosis.

Colloidal gold Temperature Plague Antigen Test Problems

※：國(guó)家自然科學(xué)基金(81260438)；※※：通訊作者，主任醫(yī)師，Email：wbq9@163.com 謝 輝(1974～)女，漢族，湖北籍， 主管醫(yī)師

R378.61

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.02.008

2015-12-23