馬曉玲，王學紅，馬臻奇，楊生森，韓慶華，王 芳，李源華

(1.青海大學醫(yī)學院； 2.青海大學附屬醫(yī)院)

青海地區(qū)幽門螺桿菌感染、p53基因Arg72Pro單核苷酸多態(tài)性與胃癌易感性#

馬曉玲1，王學紅2##，馬臻奇2，楊生森2，韓慶華2，王 芳2，李源華2

(1.青海大學醫(yī)學院； 2.青海大學附屬醫(yī)院)

目的 檢測青海地區(qū)幽門螺桿菌在胃癌患者中的感染情況，并探討青海地區(qū)Hp感染及p53Arg72Pro基因多態(tài)性與胃癌的關系。方法 用14C尿素呼氣試驗或快速尿素酶試驗檢測研究對象的Hp感染情況；采用TaqMan探針和實時定量PCR技術檢測青海地區(qū)健康人群和胃癌患者p53Arg72Pro的基因多態(tài)性。并行相關分析。結果 Hp感染率在對照組和胃癌組分別為42.2%，63.1%，Hp感染率在兩組間具有顯著差異(P<0.05 )。p53Arg72Pro有Arg/Arg、Arg/Pro、Pro/Pro 3種基因型，其頻率在胃癌患者中分別為11.3 %、58.9 %、29.8%；在健康人群中分別為16.4%、49.2%、34.3%。與Arg/Arg基因型相比，Pro/Pro基因型攜帶者在胃癌組和對照組間差異有統(tǒng)計學意義(OR 值為1.256，95%CI：1.057～2.845)。等位基因Arg和等位基因Pro在胃癌組中的頻率分別為35.1%、64.9%，在對照組中分別為41.0%、59.0%，兩組間有差異(P<0.05 )；攜帶等位基因Pro患胃癌的風險為對照組的1.286倍。按Hp是否感染對p53Arg72Pro等位基因頻率在胃癌組和對照組中進行分析，結果是三種基因型在胃癌組和對照組間的分布無差異。并將Pro/Pro與Arg/Arg、Arg/Arg與Pro/Pro+ Pro/Arg做比較，分析其與胃癌發(fā)病的相關風險發(fā)現(xiàn)亦無相關性。結論 青海地區(qū)幽門螺桿菌感染率在胃癌患者中偏高；青海地區(qū)Hp感染及p53Arg72Pro基因多態(tài)性與胃癌的發(fā)生不存在關聯(lián)。青海地區(qū)P53Arg72Pro位點基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病的風險相關，若同時攜帶Pro等位基因，胃癌發(fā)生風險明顯增加。

青海地區(qū) 幽門螺桿菌 p53Arg72Pro 單核苷酸 基因多態(tài)性 胃癌

2014年全球癌癥報告顯示，我國胃癌發(fā)病率與死亡率均居世界首位，全球接近50%的新發(fā)胃癌病例來自中國[1]，而青海又為中國的高發(fā)區(qū)。幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)被認為是胃癌發(fā)生的獨立危險因素。然而，在Hp感染人群中僅有少數(shù)個體發(fā)展為胃癌，說明胃癌發(fā)生是一個多基因、多步驟的進行性癌變過程，其中癌基因的活化和抑癌基因的失活顯得舉足輕重。研究表明p53在已發(fā)現(xiàn)抑癌基因中與人類腫瘤相關性最高[2]，是重要的細胞周期調節(jié)、凋亡基因。在絕大多數(shù)腫瘤細胞中均可發(fā)現(xiàn)P53蛋白的積聚現(xiàn)象，并與P53基因突變或缺失有關。在國外不同種族和人群中對P53 基因多態(tài)性(P53Arg72 Pro)與多種腫瘤易感性的研究均有大量報道，但結果不一。本研究旨在探討青海地區(qū)Hp感染、P53Arg72 Pro多態(tài)性與胃癌易感性的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2012年4月至2015年11月在青海大學附屬醫(yī)院胃鏡和組織活檢病理診斷為胃癌的309例患者為研究組，其中男214 例，女 95例，平均年齡(53.27±8.95)歲；同時期在同醫(yī)院體檢排除腫瘤和消化系統(tǒng)疾病的健康體檢人群329例為對照組，其中男210例，女119例，平均年齡(52.14±8.05)歲。研究對象為兩周內(nèi)未用過H2RA和PPI，1月內(nèi)未用過抗生素、鉍劑和有抗菌作用的中藥，無活動性消化道出血者。兩組性別、年齡無差異，P>0.05。

1.2 實驗方法

1.2.1 Hp感染檢測

14C尿素呼氣實驗：囑患者在安靜狀態(tài)下空腹口服14C尿素膠囊15～20 min后，向集氣卡中吹氣3～5 min，當集氣卡上橘紅色標識變?yōu)辄S色時將集氣卡置于14C分析儀(深圳海得威公司)檢測，結果≥100 dpm視為Hp陽性，結果<100 dpm為陰性。

快速尿素酶試驗：取胃竇小彎黏膜組織1塊，用快速尿素酶診斷試劑(廣州貝思奇診斷試劑有限公司)在3～5 min內(nèi)觀察顏色變化，紅色或紫紅色視為陽性，顏色不變?yōu)殛幮浴?/p>

結果判定：參照2012年中華醫(yī)學會消化病分會制訂的《第四次全國幽門螺桿菌感染處理共識報告》中的診斷標準，14C尿素呼氣實驗或快速尿素酶試驗任何一項呈陽性即視為Hp感染。

1.2.2 血液標本采集

用真空采集管抽取胃癌組、對照組個體空腹靜脈血5 mL，EDTA抗凝，轉移2 mL至EP管，置于-80 ℃冰箱保存待檢。

1.2.3 外周血基因組DNA的提取

使用血液基因組DNA快速抽提試劑盒(SK8224)抽提外周血白細胞DNA，嚴格按照說明書操作，試劑盒購自Sangon Biotech Shanghai Co.，Ltd(上海生工生物工程有限公司，簡稱上海生工)。將提取的基因組DNA調整濃度后置于-20 ℃冰箱保存，用于PCR擴增模板。

1.2.4 P53基因Arg72Pro單核苷酸多態(tài)性檢測

采用TaqMan探針和實時定量PCR技術檢測研究對象P53Arg72Pro的基因多態(tài)性。探針及其引物由上海生工合成。

(7)公眾滿意程度。在農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展過程中，本文使用農(nóng)村居民家庭人均可支配收入(千元)來表示公眾滿意程度，用x7來表示。從經(jīng)濟理論和實際情況可以發(fā)現(xiàn)，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術、農(nóng)業(yè)自然資源利用效率等都與農(nóng)村收入有著極大的關系，當農(nóng)村收入較高時，居民的消費水平提高，消費觀念有所變動，對產(chǎn)品從之前追求高產(chǎn)量轉向追求高品質，有利于促進綠色農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)，推動農(nóng)業(yè)的綠色發(fā)展。綠色農(nóng)產(chǎn)品又是目前市場上所需要的，這反過來又會提高農(nóng)村收入水平，形成一個良性循環(huán)，提高了公眾滿意度。

Primer引物序列：

正向引物5′-CCCAAGCAATGGATGATTTGA-3′；

反向引物5′-GGGCCGCC-GGTGTAG-3′。

特異性TaqMan探針序列：

FAM-CTCCCCGCGTGGCCCC-TAMRA；

TEX-CTCCCCCCGTGGCCCCT-TAMRA。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 研究對象Hp感染情況(表1)

胃癌組研究對象309例，其中Hp陽性數(shù)195例，Hp陽性率63.1%；對照組Hp陽性數(shù)139例，Hp陽性率42.2%。胃癌組與對照組間有統(tǒng)計學差異(χ2=27.79，P=0.001)。

表1 不同組別研究對象Hp感染情況(%)

Table 1 Situation of Hp infection in different groups(%)

2.2 研究對象p53Arg72Pro基因型和基因頻率分布情況(表2)

P53Arg72Pro多態(tài)性位點有Arg/Arg、Arg/Pro和Pro/Pro 3種基因型。經(jīng)檢驗基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)律(P>0.05)。Arg/Arg、Arg/Pro和Pro/Pro其頻率在胃癌組中分別為11.3%，58.9%和29.8%，在對照組中分別為16.4%，49.2%和34.3%。經(jīng)χ2檢驗胃癌組與對照組間有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。與P53基因Arg/Arg純合子基因型相比，攜帶Pro/Pro純合子基因型的個體在胃癌組顯著增高，OR值為1.256，(95%CI：1.057～2.845)。將Arg+Pro基因合并后在對照組與胃癌組間比較未見統(tǒng)計學差異(χ2=3.434，P=0.064)。攜帶Pro等位基因的個體在胃癌組是健康對照組的1.286倍(OR=1.286，95%CI：1.025～1.613)。

表2 P53Arg72Pro基因型和基因頻率在兩組中的分布(n，%)

Table 2 distribution of P53Arg72Pro genotype and gene frequency in the two groups(n，%)

2.3 Hp陽性者P53Arg72Pro基因型和基因頻率及與胃癌發(fā)病風險相關性(表3～4)

按Hp是否感染對P53Arg72Pro等位基因頻率在胃癌組和對照組中進行分析，結果是三種基因型在胃癌和對照組間的分布無差異。并將Pro/Pro與Arg/Arg、Arg/Arg與Pro/Pro+ Pro/Arg做比較分析：與胃癌發(fā)病相關風險無相關性。

表3 Arg/Arg、Pro/Pro基因型與胃癌發(fā)病風險(%)

Table 3 Arg/Arg，Pro/Pro genotype and their relation with the risk of gastric cancer(%)

表4 Arg/Arg、Pro等位基因型與胃癌發(fā)病風險(%)

Table 4 Arg/Arg，Pro allele and their relation with the risk of gastric cancer(%)

3 討論

青海地區(qū)平均海拔在3 000米以上，氣候屬典型的高原內(nèi)陸性氣候，表現(xiàn)為低壓、低氧、多風，日溫差、年溫差大，世居人群長期處于高寒、低氧環(huán)境中，易造成人體血管的收縮，血液黏稠度增高并加重組織缺血缺氧，胃黏膜亦處于低氧狀態(tài)，可導致胃黏膜屏障受損和Hp的定植[3-4]；飲食不規(guī)律及刺激性食物攝入等造成胃黏膜的機械性損傷，長期刺激引起胃黏膜病變，如慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、胃潰瘍及或胃黏膜腸上皮化生等。胃黏膜慢性炎性反應、胃黏膜上皮細胞分泌功能的紊亂，黏膜屏障的破壞及胃黏膜微環(huán)境的改變造成Hp的定植與生長，上述綜合因素極易造成胃黏膜的癌變。這其中Hp感染是胃癌發(fā)生的主要生物因素[5]。有許多研究結果提示Hp是胃癌發(fā)生發(fā)展的第一致癌物質[6]。人體一旦發(fā)生感染將終身攜帶，除根除治療，別無他法。本研究顯示青海地區(qū)胃癌患者Hp陽性率為63.1%，明顯高于對照組，Hp陽性者患胃癌的風險是陰性者的2.338倍。P53是Deleo等[7]在猿病毒40轉染細胞研究中首先發(fā)現(xiàn)，具有調控細胞周期和保護細胞染色體免受損傷的功能。該基因定位于17號染色體，約有20個堿基對，由11個外顯子和10個內(nèi)含子組成。P53基因表達蛋白生物學功能體現(xiàn)在G1/S期校正點的監(jiān)測上，P53蛋白G1/S期短暫活化，延長其進入S期的時間，從而引起細胞周期阻滯，使得DNA及時修復[8]。胃癌常見的遺傳學改變就是該基因的突變，主要發(fā)生在5～8外顯子高度保守序列上，產(chǎn)生野生型和突變型兩種基因，其中突變型P53基因能促進細胞增殖轉化，引起凋亡受阻，具有致癌作用。P53基因是一個重要的抑癌基因，當細胞嚴重損害時，P53可以使細胞發(fā)生凋亡[9]。

最新研究發(fā)現(xiàn)，P53基因多態(tài)性除存在于第5～8外顯子的序列上外，在第4外顯子亦存在，72密碼子具有CGT/CCT單核苷酸多態(tài)性。而Tara等通過研究也發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性在胃癌發(fā)生中是大概率事件[10]。編碼該基因多態(tài)性由精氨酸或脯氨酸堿基對的改變實現(xiàn)：純合的精氨酸(Arg/Arg)、純合的脯氨酸(Pro/Pro)、雜合子(Pro/Arg)[11-12]。這些多態(tài)性轉錄的蛋白通過電泳檢測和體外功能分析，P53(Pro/Pro)基因型蛋白的轉錄誘導能力強于Arg型蛋白；而P53(Arg/Arg)基因型蛋白誘導凋亡能力卻強于Pro型蛋白。目前關于P53Arg72Pro基因多態(tài)與胃癌易感性關系的研究報道不多，且結論不盡相同。Hiyama T[13]等報道日本人等位基因Arg在胃癌組和對照組中分布無顯著性差異。Zhang 等[14]在隨后的研究中得到了類似的結論。魏桃[15]等研究亦顯示P53基因第72密碼子多態(tài)性與胃癌發(fā)生無相關性。Shen[16]等研究報道基因型Pro/Arg以及Pro/Arg+Arg/Arg發(fā)生胃癌的風險分別為1.5和1.44，95%CI分別為0.97～2.32和0.95～2.18。單勇等[17]采用TaqMan實時熒光定量PCR方法檢測研究對象P53基因Arg72Pro的多態(tài)性，結果顯示Pro基因型攜帶者的胃癌發(fā)病風險是Arg/Arg基因型攜帶者的1.846倍，這與我們的研究結果相似：與P53基因Arg/Arg純合子基因型相比，攜帶Pro/Pro純合子基因型的個體在胃癌組顯著增高，OR值為1.256，(95%CI：1.057～2.845)。攜帶Pro等位基因的個體在胃癌組是健康對照組的1.286倍(OR=1.286，95%CI：1.025～1.613)。究其原因，可能與pro基因型使p53 基因抑癌功能改變、凋亡能力降低相關。

Ierardi、高歌等[18-19]發(fā)現(xiàn)在Hp感染的癌前病變及胃癌中常伴有P53基因突變。范惠珍[20]等研究的結果也提示Hp感染增強野生型P53(wt-P53)變異表達，進而參與胃癌發(fā)生。朱克祥等[21]認為Hp對攜帶P53Pro等位基因誘導突變能力強于攜帶Arg/Arg基因型，從而發(fā)生胃癌。而本研究按Hp是否感染P53Arg72Pro等位基因頻率在胃癌組和對照組中進行分析，結果發(fā)現(xiàn)Arg/Arg、Arg/Pro、Pro/Pro三種基因型在胃癌組和對照組間的分布無差異。并將Pro/Pro與Arg/Arg、Arg/Arg與Pro/Pro+Pro/Arg做比較分析其與胃癌發(fā)病的相關風險發(fā)現(xiàn)亦無相關性，提示P53基因Arg72Pro多態(tài)性與胃癌組Hp感染情況無顯著相關性。

中國屬于國際胃癌高發(fā)國之一，青海又是國中高發(fā)區(qū)，胃癌檢出率為7.79%[22]。將青海地區(qū)胃癌病例作為研究對象具有重要的地域性意義。本研究結果顯示，Hp感染率較高，與胃癌高發(fā)可能存在關聯(lián)；p53Arg72Pro多態(tài)性與胃癌組Hp感染情況無顯著相關性。青海地區(qū)P53Arg72Pro位點基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病的風險相關，若同時攜帶Pro等位基因，胃癌發(fā)生風險明顯增加。關于青海地區(qū)Hp與P53Arg72Pro位點基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病風險所得結論只能視為初步研究結果，進一步結論需要擴大樣本論證。

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The relationship between Helicobacter pylori infection，single nucleotide polymorphism of p53 gene Arg72Pro and gastric cancer in Qinghai area#

Ma Xiaoling1，Wang Xuehong2##，Ma Zhenqi2，Yang Shengseng2，Han Qinghua2，Wang Fang2，Li Yuanhua2

(1.Qinghai University Medical College；2.Affiliated Hospital of Qinghai University)

Objective To investigate the situations of Helicobacter pylori infection in patients with gastric cancer at Qinghai province，then explore the relationship between the polymorphism of P53Arg72Pro as well as the Helicobacter pylori infection and gastric cancer in Qinghai.Methods To determine the infection rate of Helicobacter pylori with the14C urea breath test(14C-UBT)as well as the rapid urease test(RUT).To detect the polymorphism of P53Arg72Pro through the real-time PCR(TaqMan)among the patients with gastric carcinoma and the normal individuals in the region of Qinghai.And carried out the correlation analysis as well.Results The rates of Helicobacter pylori infection were 63.1% in the gastric carcinoma patients and 42.2% in the healthy control group，with a significant difference between the two groups(P<0.05).Three genotypes of P53Arg72Pro were identified：Arg/Arg，Arg/Pro and Pro/Pro.The frequencies of these three genotypes are 11.3%，58.9% and 29.8 %，respectively，among the patients with gastric cancer，and the corresponding values were 16.4%，49.2%and34.3%，respectively，among the control group.Compared with Arg/Arg genotype，the results of Pro/Pro genotype have a significant difference between cancer patients and controls(The value of OR is 1.256，95%CI：1.057-2.845).The frequencies of Arg and Pro alleles are 35.1% and 64.9%，respectively，for the patients with gastric cancer and those values are 41.0% and 59.0%，respectively，for the control group of healthy people，which showed a significant difference(P<0.05 ).The risk of gastric cancer for the carriers with Pro alleles was 128% of the value for the control group.The frequencies of p53Arg72Pro allele in the patients with gastric cancer and the group of healthy people were analyzed whether or not infected with Helicobacter pylori.The result showed that there were no difference between the three genotypes in gastric cancer and control group.And the comparative analysis for Pro/Pro and Arg/Arg，Arg/Arg and Pro/Pro +Pro/Arg showed that there was no risks associated with gastric cancer susceptibility.Conclusion The rate of Helicobacter pylori infection in patients with gastric cancer is high in Qinghai area；There is no association between Hp infection and p53Arg72Pro gene polymorphism or the susceptibility of gastric cancer in Qinghai region.P53Arg72Pro loci polymorphisms are associated with the risk of gastric cancer in Qinghai area，if carry Pro allele at the same time，significantly increased the susceptibility risk of gastric cancer.

Qinghai area Helicobacter pylori Arg72Pro p53 Single nucleotide Gene polymorphism Gastric cancer

R394

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.02.005

2016-01-09

#：青海省自然科學基金(2012-Z-908)；##：通訊作者，主任醫(yī)師，E-mail：lindawang0710@ hotmail.com 馬曉玲(1988～)，女，回族，青海籍，青海大學醫(yī)學院2013級內(nèi)科班碩士研究生