李思霖，南星梅，2，李占強(qiáng)，2，黨占翠，2，吳 萍**，蘆殿香，2***

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2.青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

藏藥三味檀香散對(duì)離體大鼠肺小動(dòng)脈的舒張作用及機(jī)制*

李思霖1，南星梅1，2，李占強(qiáng)1，2，黨占翠1，2，吳 萍1**，蘆殿香1，2***

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2.青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

目的 研究藏藥三味檀香散對(duì)離體大鼠肺小動(dòng)脈的舒張作用并探討其可能機(jī)制。方法 利用去甲腎上腺素(NE)和氯化鉀(KCl)預(yù)收縮離體大鼠肺小動(dòng)脈，比較三味檀香散95%乙醇提取物和水提物的舒血管作用；研究不同工具藥對(duì)醇提物舒血管作用的影響。結(jié)果 三味檀香散醇提物和水提物均可抑制NE(1μmol·L-1)引起的肺小動(dòng)脈的收縮作用。其中，醇提物的舒血管作用更優(yōu)，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在濃度為0.3、0.9mg/mL時(shí)，水提物對(duì)KCl(60mmol·L-1)預(yù)收縮血管環(huán)的作用優(yōu)于醇提物(P<0.05)。在0.6、0.9mg/mL時(shí)，一氧化氮合酶阻斷劑左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME，100μmol·L-1)和前列環(huán)素合酶阻斷劑吲哚美辛(IMT，10μmol·L-1)均能抑制醇提物對(duì)肺小動(dòng)脈環(huán)的舒張作用(P<0.05)，在0.9mg/mL濃度時(shí)，IMT的阻斷作用優(yōu)于L-NAME。電壓依賴性K+通道(Kv)阻斷劑4-氨基吡啶(4-AP，1mmol·L-1)、內(nèi)向整流K+通道(KIR)阻斷劑氯化鋇(BaCl2，1mmol·L-1)、鈣激活K+通道(KCa)阻斷劑四乙基氯化銨(TEA)均可抑制醇提物對(duì)肺小動(dòng)脈環(huán)的舒張作用(P<0.05)。結(jié)論 三味檀香散95%醇提物對(duì)NE預(yù)收縮血管環(huán)的舒張作用優(yōu)于水提物。藥物醇提物舒張大鼠肺小動(dòng)脈的可能作用機(jī)制：1)通過(guò)抑制細(xì)胞膜受體門(mén)控性鈣通道，減少Ca2+流入血管平滑肌細(xì)胞引起血管舒張；2)作用于肺小動(dòng)脈內(nèi)皮，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮(NO)和前列環(huán)素(PGI2)至平滑肌使平滑肌舒張；3)作用于肺小動(dòng)脈平滑肌的鉀離子通道(Kv，KIR，KCa)，促進(jìn)通道開(kāi)放引起血管平滑肌舒張。

三味檀香散 提取物 血管舒張作用 機(jī)制

藏藥三味檀香散，又名贊旦松湯，原載于藏醫(yī)學(xué)經(jīng)典著作《四部醫(yī)典》，由檀香、肉豆蔻、廣棗三味組成，是藏醫(yī)臨床治療“心熱病”的經(jīng)典常用藏醫(yī)藥方。楊梅等將大鼠置于模擬海拔5000 m的低壓氧艙內(nèi)，研究三味檀香散對(duì)大鼠肺動(dòng)脈壓和右心室肥厚重構(gòu)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，三味檀香散不僅可以有效降低HAPH大鼠的平均肺動(dòng)脈壓，而且明顯減輕HAPH大鼠右心室的重構(gòu)[1]。為了明確三味檀香散干預(yù)低氧性肺動(dòng)脈高壓發(fā)生的機(jī)制，本研究制備了三味檀香散95%乙醇提取物和水提物，利用去甲腎上腺素(NE)和氯化鉀(KCl)預(yù)收縮大鼠離體肺小動(dòng)脈血管環(huán)，觀察三味檀香散醇提物和水提物對(duì)預(yù)收縮血管環(huán)的影響，以此分析藥物藥理作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(陜)2012-003，西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量(250±20)g，大鼠自由進(jìn)食飲水]。三味檀香散(青海省藏醫(yī)院)。重酒石酸去甲腎上腺素注射液(Norephinephrine，NE，國(guó)藥準(zhǔn)字H12020621，天津金耀氨基酸有限公司)，N-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽(L-NAME，批號(hào)：101150336，Sigma)，四乙基氯化銨(TEA，批號(hào)：28460，貨號(hào)：1040692，Sigma)，4-氨基吡啶(4-AP，貨號(hào)：275875，Sigma)，吲哚美辛(IMT，貨號(hào)：18280，Sigma)，氯化鋇(BaCL2，批號(hào)：1001900129，Sigma)，Krebs-Henseleit(K-H)液(氯化鈉118，氯化鉀4.7，氯化鈣2.5，硫酸鎂1.2，磷酸二氫鉀1.2，碳酸氫鈉25，葡萄糖11.1mmol·L-1；PH=7.4；無(wú)機(jī)鹽試劑均為市售分析純?cè)噭?。RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，Alpha1-2 plus型冷凍干燥器(德國(guó)Christ公司)，張力傳感器(JH-2，中國(guó)北京航空醫(yī)學(xué)研究所)，BL-420F型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，HV-4型離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 三味檀香散95%乙醇提取物和水提物的制備

95%乙醇提取物制備：取三味檀香散藥粉30.00 g，置于500 mL燒瓶中，加入150 mL 95%的分析乙醇，回流提取3次，每次60 min，合并提取液旋蒸濃縮至膏狀物，再用去離子水定容至400 mL。分裝并置于-20 ℃冰箱內(nèi)備用。

水提物制備：取三味檀香散藥粉30.00 g，置于500 mL燒瓶中，加入150 mL純凈水，回流提取3次，每次60 min，合并提取液旋蒸濃縮至膏狀物，再用去離子水定容至400 mL。分裝并置于-20 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.2 大鼠肺小動(dòng)脈血管環(huán)的分離及離體血管環(huán)灌流實(shí)驗(yàn)

20%烏拉坦腹腔注射(0.5mL/0.1kg)麻醉大鼠，仰臥固定，打開(kāi)胸腔，將心肺快速取出，置于氧飽和的、冰浴的KH液中。剪下肺葉(左肺上葉)，用大頭針固定肺葉于冰浴的KH液中。快速鈍性分離2～3級(jí)肺動(dòng)脈，分離過(guò)程中避免牽拉肺動(dòng)脈，盡量保持動(dòng)脈環(huán)完整。隨后將分離的肺小動(dòng)脈剪成平均長(zhǎng)度為2 mm的血管環(huán)。

將肺動(dòng)脈環(huán)固定在上下兩根三角形掛鉤上，其中一個(gè)掛鉤連接張力傳感器，另外一個(gè)掛鉤固定在通氣桿上。實(shí)驗(yàn)期間，血管環(huán)被浸泡在含有10 mL KH液的組織浴槽內(nèi)，期間持續(xù)通入混合氣體(95%O2+5%CO2)，并保持37 ℃恒溫。給予血管環(huán)300～400 mg基礎(chǔ)張力，并在此環(huán)境下平衡約120 min后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。平衡期間每隔15 min將組織浴槽內(nèi)的KH液更換為新鮮的氧飽和的37℃ KH液。血管的張力變化通過(guò)張力傳感器輸入信號(hào)采集系統(tǒng)，最后呈現(xiàn)并記錄在計(jì)算機(jī)上。舒張率=(藥物引發(fā)的張力)/1μmol·L-1NE或60mmol·L-1KCl引發(fā)的張力)×100%。

1.2.3 三味檀香散對(duì)NE和KCl預(yù)收縮血管環(huán)的作用及其機(jī)制研究

肺動(dòng)脈環(huán)調(diào)至基礎(chǔ)張力后，平衡至最佳狀態(tài)。在基礎(chǔ)狀態(tài)下，向浴槽內(nèi)加入NE(1μmol·L-1)，待肺動(dòng)脈收縮達(dá)到最大值并進(jìn)入平臺(tái)期后，向浴槽內(nèi)累積加入三味檀香散95%乙醇提取物(0.3～0.9mg/mL)或者水提物(0.3～1.2mg/mL)，對(duì)照組累積加入相同體積的KH液，觀察藥物對(duì)NE預(yù)收縮肺動(dòng)脈張力的影響。

肺動(dòng)脈環(huán)調(diào)至基礎(chǔ)張力后，平衡至最佳狀態(tài)。在基礎(chǔ)狀態(tài)下，向浴槽內(nèi)加入KCl(60mmol·L-1)，待肺動(dòng)脈收縮達(dá)到最大值并進(jìn)入平臺(tái)期后，向浴槽內(nèi)累積加入三味檀香散95%乙醇提取物或水提物(0.3～1.2mg/mL)，對(duì)照組累積加入相同體積的KH液，觀察藥物對(duì)KCl預(yù)收縮肺動(dòng)脈張力的影響。

阻斷劑對(duì)三味檀香散舒張NE預(yù)收縮大鼠離體肺動(dòng)脈影響的實(shí)驗(yàn)方法如下：將肺動(dòng)脈調(diào)整至基礎(chǔ)張力，并平衡至最佳狀態(tài)，向組織浴槽內(nèi)加入NE(1μmol/L)，待血管環(huán)收縮至最大值，并且出現(xiàn)平臺(tái)期之后，分別加入L-NAME(100μmol·L-1)、IMT(10μmol·L-1)、4-AP(1mmol·L-1)、BaCL2(1mmol·L-1)、TEA(1mmol·L-1)，對(duì)照組加入相同體積的KH液，待新的平臺(tái)期出現(xiàn)后，再向各個(gè)組織浴槽內(nèi)累積加入三味檀香散95%乙醇提取物(0.3～0.9mg/mL)，觀察張力的變化。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 三味檀香散醇提物和水提物對(duì)NE預(yù)收縮肺小動(dòng)脈舒張率(%)影響的結(jié)果(表1)

Table 1 95% ethanol and aqueous extracts of Sanweitanxiang on NE pre-contracting pulmonary artery vasorelaxation

表1顯示，三味檀香散95%乙醇提取物(0.3～0.9mg/mL)和水提物(0.3～1.2mg/mL)均可呈劑量依賴性地舒張NE預(yù)收縮的肺小動(dòng)脈。與水提物相比，95%乙醇提取物對(duì)NE預(yù)收縮肺小動(dòng)脈的舒張作用更優(yōu)，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 三味檀香散醇提物和水提物對(duì)KCl預(yù)收縮肺小動(dòng)脈舒張率(%)影響的結(jié)果(表2)

Table 2 95% ethanol and aqueous extract of Sanweitanxiang on KCl pre-contracting pulmonary artery vasorelaxation

表2顯示，三味檀香散95%乙醇提取物和水提物(0.3～1.2mg/mL)均可呈劑量依賴性地舒張KCl預(yù)收縮的肺小動(dòng)脈。在濃度為0.3、0.9mg/mL時(shí)，水提物對(duì)KCl預(yù)收縮血管環(huán)的作用優(yōu)于醇提物(P<0.05)。

2.3 L-NAME和IMT預(yù)處理對(duì)三味檀香散醇提物舒張NE預(yù)收縮肺小動(dòng)脈舒張率(%)作用影響的結(jié)果(表3)

Table 3 95% ethanol extract of Sanweitanxiang on NE pre-contracting pulmonary artery vasorelaxation treated by L-NAME and IMT

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；▲：與L-NAME組比較，P<0.05.

表3顯示，三味檀香散醇提物對(duì)NE預(yù)收縮肺小動(dòng)脈血管環(huán)的舒張作用能夠被L-NAME、IMT不同程度地阻斷，兩組的最大舒張率分別為61.07±1.74、31.73±0.58，低于對(duì)照組的最大舒張率(79.73±2.71，P<0.05)。在濃度為0.6、0.9mg/mL時(shí)，L-NAME和IMT均能阻斷醇提物對(duì)肺小動(dòng)脈環(huán)的舒張作用(P<0.05)，在0.9mg/mL時(shí)，IMT的阻斷作用優(yōu)于L-NAME。

2.4 4-AP、BaCl2和TEA預(yù)處理對(duì)三味檀香散醇提物舒張NE預(yù)收縮肺小動(dòng)脈舒張率(%)作用影響的結(jié)果(表4)

Table 4 95% ethanol extract of Sanweitanxiang on NE pre-contracting pulmonary artery vasorelaxation in presence of 4-AP，BaCl2and TEA

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；▲：與4-AP組比較，P<0.05；△：與BaCl2組比較，P<0.05.

表4顯示，三味檀香散醇提物對(duì)NE預(yù)收縮肺小動(dòng)脈血管環(huán)的舒張作用能夠被4-AP、BaCl2和TEA不同程度地阻斷，三組的最大舒張率分別為63.00±1.67、21.42±0.88、39.59±0.35，低于三味檀香散對(duì)照組的最大舒張率(79.73±2.71，P<0.05)。在濃度為0.6、0.9mg/mL時(shí)，BaCl2的阻斷作用優(yōu)于4-AP和TEA(P<0.05)。

3 討論

血管張力的維持主要受血管平滑肌的收縮和內(nèi)皮依賴性舒張兩者的動(dòng)態(tài)調(diào)控。細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流及細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放所產(chǎn)生的Ca2+，在血管平滑肌的收縮中起關(guān)鍵作用。細(xì)胞膜上的受體門(mén)控性鈣通道、電壓門(mén)控性鈣通道在調(diào)控細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流中起主要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，三味檀香散95%乙醇提取物和水提物均可呈劑量依賴性地舒張NE和KCl預(yù)收縮的肺小動(dòng)脈。其中，95%乙醇提取物對(duì)NE預(yù)收縮血管環(huán)的舒張作用更優(yōu)，而醇提物和水提物對(duì)KCl預(yù)收縮的肺小動(dòng)脈無(wú)明顯的舒張作用(最大舒張率僅在35%左右)，說(shuō)明這種舒張作用與抑制受體門(mén)控性鈣通道的作用有關(guān)，與抑制電壓門(mén)控性鈣通道的關(guān)系較小[2-3]。

血管內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)可以催化L-精氨酸生成NO，NO進(jìn)入血管平滑肌細(xì)胞，激活可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，產(chǎn)生cGMP，通過(guò)cGMP依賴性蛋白激酶使Ca2+內(nèi)流減少，增加肌漿網(wǎng)上鈣ATP酶對(duì)Ca2+的攝取或直接作用于收縮蛋白去磷酸化而使血管發(fā)生舒張[4]。

我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，L-NAME預(yù)處理能降低三味檀香散95%醇提物的舒血管作用，提示三味檀香散可能通過(guò)NO途徑介導(dǎo)血管舒張的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞還可產(chǎn)生PGI2。PGI2可以作用于血管的平滑肌細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)cAMP生成增加，從而導(dǎo)致血管的舒張。本研究顯示，用吲哚美辛抑制環(huán)氧合酶可以減弱藥物的舒血管作用，提示三味檀香散可能通過(guò)環(huán)氧合酶途徑發(fā)揮血管舒張的作用[5]。

在研究K+通道阻斷劑對(duì)三味檀香散舒張肺小動(dòng)脈的影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，電壓依賴性K+通道(Kv)阻斷劑4-氨基吡啶(4-AP)、大電導(dǎo)鈣激活性鉀離子通道(BKCa)和內(nèi)向整流鉀離子通道(KIR)阻斷劑(TEA和BaCL2)能夠不同程度地阻斷三味檀香散醇提物對(duì)大鼠肺小動(dòng)脈的舒張作用，說(shuō)明藥物可能促進(jìn)了鉀通道的開(kāi)放，從而引起血管平滑肌的舒張[6]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7]，NO-cGMP通路在內(nèi)皮依賴性的血管舒張中占主要地位。NO誘導(dǎo)的血管舒張作用部分依賴于cGMP、PKG介導(dǎo)的大電導(dǎo)鈣激活性鉀離子通道(BKCa)的活化。因此我們推測(cè)，三味檀香散95%乙醇提取物誘導(dǎo)的大鼠肺小動(dòng)脈的舒張作用可能是通過(guò)作用于NO-cGMP-PKG- BKCa通路，引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平下降而導(dǎo)致血管舒張。

[1]陳宏，趙媛，李亞楠，等.三味檀香散預(yù)處理對(duì)低壓低氧性大鼠右心室重構(gòu)的影響[J].青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，36(3)153-157.

[2]VS Alfredo Augusto，F(xiàn)JBD Lima，TSD Brito，et al.Vasorelaxation induced by methyl cinnamate，themajorconstituent of the essential oil of Ocimum micranthum，in rat isolated aorta[J].Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology，2014，41(10)：755-762.

[3]YY Tian，Y Yu，J Yu，et al.Vasodilatory Effect of a Novel Rho-Kinase Inhibitor，DL0805-2，on the ratMesenteric Artery and its Potential Mechanisms[J].Cardiovascular Drugs and Therapy，2014，28(5)：415-424.

[4]G Santulli，H Domínguez，R Lucas，et al.The new nitric oxide donor cyclohexane nitrate induces vasorelaxation，hypotension，and antihypertensive effects via NO/cGMP/PKG pathway[J]. Frontiers in Physiology，2015，1(6)：1-9.

[5]SZ Mao，L Hong，HU Liang-Gang，et al.Effect of apelin on hypoxic pulmonary hypertension in rats：role of The NO pathway[J].Acta physiologica Sinica，2009，61(5)：480-484.

[6]Protic Dragana，R Nebojsa，S Svetlana，et al.The Role of Potassium Channels in the VasodilatationInducedby Resveratrol and Naringenin in Isolated Human Umbilical Vein[J].Drug Development Research，2015，76(1)：17-23.

[7]XY Gai，YH Wei，W Zhang et al.Echinacoside induces rat pulmonary artery vasorelaxation by openingTheNO-cGMP-PKG-BKCachannels and reducing intracellular Ca2+levels[J].Acta Pharmacologica Sinica，2015，36(5)：587-596.

Research on the Effect and Mechanism of SANWEITANXIANG Powder on Inducing Rat Pulmonary Artery Vasorelaxation

Li Silin1，Nan Xingmei1，2，Li Zhanqiang1，2，Dang Zhancui1，2，Wu Ping1**，Lu Dianxiang1，2***

(1.Medical College of Qinghai University； 2.Key laboratory of application and foundation for high altitude medicine research in Qinghai province)

Objective To investigate the Tibetan medicinal complex Sanweitanxiang powder(SWTXP)on rat pulmonary artery vasorelaxatioan in vitro and it′s mechanism.Methods NE and KCl pre-contracted pulmonary artery vascular rings methodinvitrowas used to detect the effects of aqueous extract and 95% ethanol extract of SWTXP.The effects of different tool drugs on rat’s pulmonary artery vasorelaxation by 95% ethanol extract were studied.Results The effect of pulmonary artery contraction with NE was inhibited by the aqueous extract and 95% ethanol extract.The effect of 95% ethanol extract on NE pre-contracted pulmonary artery vascular rings was better than that of the aqueous extractand showed significant statistical difference(P<0.05).The effect of aqueous extract on KCl pre-contracted pulmonary artery vascular rings was better than that of the 95% ethanol extract at concentration of 0.3mg/mL and 0.9mg/mL(P<0.05).And the effect of pulmonary artery vasorelaxation of the 95% ethanol extract was inhibited by adding L-NAME(100μmol·L-1)and IMT(10μmol·L-1)at 0.6mg/mL.And IMT performed a better inhibition effect than that of L-NAME at 0.9mg/mL(95% ethanol extract).Additionally，the pulmonary artery vasorelaxation of the 95% ethanol extract was also inhibited by 4-AP(1mmol·L-1)，BaCl2(1mmol·L-1)and TEA(1mmol·L-1).Conclusions The effect of 95% ethanol extract on NE pre-contracted pulmonary artery vascular rings was better than that of the deionized water extract.And the mechanism weve included as follows：1)The vasorelaxation effect was based on inhibiting receptor-operated calcium channel which reducing intracellular Ca2+levels；2)The 95% ethanol extract could increase NO and PGI2concentration by influencing pulmonary artery endothelium which played a role in inducing pulmonary artery vasorelaxation；3)The 95% ethanol extract could induce vasorelaxation by opening the potassium ion channels(Kv，KIRand Kca)

Sanweitanxiang powder Extracts Vasorelaxation Mechanism

*：青海省人力資源和社會(huì)保障廳2015年度留學(xué)人員科技活動(dòng)擇優(yōu)資助項(xiàng)目[青人社廳函(2015)386號(hào)，青人社廳函(2015)522號(hào)] 李思霖(1988～)，女，漢族，黑龍江籍，在讀碩士研究生.**：通訊作者，教授，wupingyixue@163.com；***：第一通訊作者，教授，ludianxiang@qhu.edu.cn

R96

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.02.012

2016-04 -04