王立豐 王紀(jì)坤 安 鋒 謝貴水

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，農(nóng)業(yè)部儋州熱帶作物科學(xué)觀測試驗站，海南儋州571737）

巴西橡膠樹核糖體蛋白HbRPL14基因逆境響應(yīng)機(jī)制

王立豐 王紀(jì)坤 安 鋒 謝貴水

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，農(nóng)業(yè)部儋州熱帶作物科學(xué)觀測試驗站，海南儋州571737）

為研究核糖體蛋白在橡膠樹逆境響應(yīng)中的作用機(jī)制，從巴西橡膠樹品種熱研7-33-97葉片中克隆了核糖體HbRPL14基因，并進(jìn)行HbRPL14蛋白的生物信息學(xué)分析及HbRPL14基因的表達(dá)分析。結(jié)果表明：其編碼蛋白含有特征性核糖體＿L14家族結(jié)構(gòu)域，該基因在橡膠樹膠乳、花和葉片中表達(dá)，但在樹皮中不表達(dá)。采用熒光定量分析技術(shù)證明干旱、機(jī)械傷害和白粉菌侵染均顯著上調(diào)HbRPL14基因表達(dá)，表明核糖體HbRPL14基因受逆境調(diào)控，通過提高核糖體蛋白合成水平，參與橡膠樹對干旱、機(jī)械傷害和白粉菌侵染的響應(yīng)。

巴西橡膠樹；干旱；核糖體蛋白；HbRPL14；基因；逆境響應(yīng)

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）起源于熱帶，在我國種植經(jīng)常面臨干旱［1］、寒害［2］等逆境脅迫，橡膠樹抗旱、抗寒和抗病等抗逆反應(yīng)與植物內(nèi)部蛋白含量或者酶活性增加顯著相關(guān)［3］。核糖體是細(xì)胞內(nèi)最重要的細(xì)胞器之一，在生物體將DNA所包含的基因信息翻譯為蛋白質(zhì)的過程中，核糖體在mRNA的指導(dǎo)下合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)。在翻譯過程中，核糖體需要解讀mRNA的密碼子，招募相應(yīng)的氨酰tRNA，并催化肽鏈的生成［4］。真核生物核糖體的沉降系數(shù)為80S，它們含有2個亞基，沉降系數(shù)分別為60S和40S［4-6］。目前，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）［7］，刺參（Apostichopus japonicus）［8］，橡膠樹［9］等多種物種中發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白，但對其在逆境相響應(yīng)過程中的作用尚不清楚。已有研究證明，核糖體蛋白會與鈣調(diào)蛋白［10］、C7orf30［3］以及核糖體蛋白之間互相結(jié)合［11］。筆者推測，作為翻譯調(diào)控的重要環(huán)節(jié)，核糖體蛋白參與橡膠樹抗逆反應(yīng)中的蛋白合成。本研究克隆了核糖體RPL14蛋白基因，采用生物信息學(xué)技術(shù)分析其定位和功能，并在干旱等處理下研究其在橡膠樹抗逆響應(yīng)中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以位于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗場二隊15年生巴西橡膠樹品種熱研7-33-97成齡開割樹為材料，采集葉片、膠乳、花和樹皮用于組織表達(dá)分析［12］。以中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗場五隊培育的熱研7-33-97芽接苗為材料，選取均勻一致的2蓬葉且頂棚葉片處于穩(wěn)定期的芽接苗進(jìn)行干旱、機(jī)械傷害和白粉菌侵染等處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物材料RNA提取和cDNA合成 膠乳、葉片等材料總RNA提取根據(jù)Qin等方法［12］，利用DNase I去除RNA中殘留的少量DNA。所提取的RNA經(jīng)紫外分光光度計測定OD230、OD260和OD280吸收值以檢測純度，同時采用1%甲醛變性膠電泳檢測RNA的完整性。cDNA第Ⅰ鏈合成參照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit，F(xiàn)ermentas試劑盒說明書［13］。

1.2.2 HbRPL14基因的克隆 根據(jù)Genbank上公布人類、擬南芥和蓖麻（Ricinus communis）等核糖體L14蛋白序列，在橡膠樹EST數(shù)據(jù)庫中做tblastn搜索，通過DNAman8.0軟件拼接同源片段，得到巴西橡膠樹核糖體RPL14基因的cDNA序列。采用primer6.0軟件設(shè)計基因特異引物RPL14F1（5’-AGAGATGACCTATGGCAATG-3’）和RPL14R1（5’-CTACAACGGAAGGAGAAAGA-3’），以反轉(zhuǎn)錄的葉片cDNA第Ⅰ鏈為模板，擴(kuò)增巴西橡膠樹核糖體蛋白HbRPL14基因的cDNA序列。使用2× Taq PCR MasterMix（天根生化）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：cDNA 2μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，2×PCR MasterMix 25 μL，加ddH2O至50μL。PCR擴(kuò)增程序為94℃變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火50 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的片段，凝膠回收純化，并克隆到pMD19-T載體上，經(jīng)菌落PCR檢測，送上海立菲生物技術(shù)有限公司廣州測序部進(jìn)行測序驗證。

1.2.3 HbRPL14蛋白的生物信息學(xué)分析 采用NCBIORF Finder在線分析工具預(yù)測基因的ORF及其編碼的氨基酸序列，通過Expasy的ProtParam在線分析軟件分析巴西橡膠樹核糖體蛋白HbRPL14蛋白中各種氨基酸含量，并預(yù)測得到理論分子量和等電點(diǎn)；用NCBI Conserved Domains數(shù)據(jù)庫和SMART在線分析軟件分析蛋白的結(jié)構(gòu)；用SignalP 4.1 Server在線分析軟件分析信號肽結(jié)構(gòu)；用TMHMM 2.0 Server在線分析軟件分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域。在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中通過Blastp搜索其他物種的核糖體蛋白HbRPL14同源蛋白并獲取其序列，利用DNAman8.0軟件進(jìn)行多重序列比對。

1.2.4 HbRPL14基因表達(dá)分析 干旱處理采用先將芽接苗澆水至飽和，然后放在光照培養(yǎng)箱進(jìn)行斷水處理，連續(xù)采集0～10 d葉片為材料［14］；機(jī)械傷害處理采用Qin等的方法［12］；白粉菌處理采用筆者的方法［15］。以熒光定量引物HbRLP14F（5’-TTCTGGCTTGTTGGACTC-3’）和HbRLP14R（5’-ATTGGCTGACCTTGCTTAT-3’）擴(kuò)增，以HbACTIN（基因登錄號：HO004792）HbACTIN F，5’-GATGTGGATATCAGGAAGGA-3’；HbACTIN R，5’-CATACTGCTTGGAGCAAGA-3’為內(nèi)參基因。使用BioRad公司的CFX-96熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性30 s；94℃5 s，60℃20 s，72℃20 s擴(kuò)增45個循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線制作，從50℃逐漸升溫至95℃，升溫速度0.2℃/s，全過程檢測熒光信號。HbRPL14的表達(dá)量采用公式Qt=2-Ct（HbACTIN）-Ct（HbRPL14）計算，Ct為每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。倍數(shù)是指處理葉片和同期對照葉片HbRPL14表達(dá)量的比值。

1.3 分析方法

采用SPSS軟件（版本號21）進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析和Duncan檢驗分析不同處理間基因表達(dá)的差異顯著性。采用Origin 2015軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbRPL14基因克隆與生物信息學(xué)分析

采用PCR擴(kuò)增技術(shù)克隆的HbRPL14基因（基因登錄號KM086720），全長1 054 bp，其5’端長度為237 bp，3’端長度為244 bp，編碼區(qū)長度為573 bp，編碼191氨基酸（圖1）。其推導(dǎo)氨基酸分子量為20.7 kDa，等電點(diǎn)10.51，分子式為C902H1492N278O256S11，為疏水性穩(wěn)定蛋白。其推導(dǎo)氨基酸與葡萄（Vitis vinifera）VvHLP（XP＿010655685.1），蓖麻（Ricinus communis）RcRPL14（XP＿002526273.1），番茄（Solanum lycopersicum）SlHLPXP＿010318617.1）和山杜英（Nicotiana sylvestris）NsHLPXP＿009803545.1）相似性分別為71.2%，75.39%，67.02%和67.54%，是60s核糖體蛋白RPL14家族成員（圖2）。

從圖3可以看出，HbRPL14推導(dǎo)的氨基酸序列不含有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，72～191位氨基酸編碼特異的Ribosomal＿L14 superfamily結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位分析表明其在線粒體基質(zhì)空間、線粒體內(nèi)膜、線粒體內(nèi)膜間隙和線粒體外膜的幾率分別為0.92、0.60、0.60和0.60，表明HbRPL14定位在線粒體上。

2.2 HbRPL14基因的表達(dá)分析

從圖4可以看出，干旱處理橡膠樹芽接苗10 d的葉片中，HbRPL14在第3天有顯著上調(diào)的表達(dá)趨勢，隨后隨著干旱處理時間的延長，其表達(dá)量逐漸下降。由此說明，核糖體蛋白HbRPL14參與橡膠樹干旱響應(yīng)的關(guān)鍵時期為第3天。

從圖5可以看出，HbRPL14在膠乳中的表達(dá)量最高，在花和葉片膠乳表達(dá)量次之，在樹皮中不表達(dá)。說明其主要在膠乳、花和葉片中起作用。

從圖6可以看出，機(jī)械傷害處理葉片后，在1～2 h上調(diào)HbRPL14的表達(dá)，隨后持續(xù)上升，其表達(dá)最高峰出現(xiàn)在機(jī)械傷害處理后的10～24 h，說明HbRPL14參與橡膠樹對機(jī)械傷害的早期反應(yīng)。白粉菌侵染后不同級別的葉片中HbRPL14的表達(dá)顯著上調(diào)，尤其在3級和4級葉片中上調(diào)分別為6倍左右（圖7）。說明白粉菌侵染會導(dǎo)致核糖體蛋白HbRPL14表達(dá)的顯著增加，與干旱和機(jī)械傷害的結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

本試驗克隆的HbRPL14基因含有核糖體L14蛋白家族特征的結(jié)構(gòu)域，參與橡膠樹對干旱、機(jī)械傷害和白粉菌侵染的響應(yīng)。

鑒于核糖體蛋白在翻譯中的作用，對核糖體蛋白的結(jié)構(gòu)和定位研究十分深入［16-19］。發(fā)現(xiàn)其定位在線粒體中［16］，受磷酸化調(diào)控［17］，并獲得了玉米（Zea mays）［20］、衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）［21］和大腸桿菌（Escherichia coli）［22］核糖體蛋白L14的序列［23-24］。本試驗從橡膠樹品種熱研7-33-97葉片中克隆了HbRPL14基因，與葡萄和蓖麻中的核糖體蛋白RPL14相似度達(dá)70%以上，含有特征性核糖體＿L14結(jié)構(gòu)域，沒有跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽，并具有定位在線粒體的特點(diǎn)，說明HbRPL14是植物核糖體蛋白RPL14家族成員。

近年來，核糖體蛋白L14調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展十分迅速，發(fā)現(xiàn)油菜素內(nèi)酯調(diào)控核糖體蛋白在擬南芥懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的核分裂中起作用［25］。隨后，又發(fā)現(xiàn)核糖體基因參與酵母凋亡的線粒體依賴途徑［26］，核糖體調(diào)控機(jī)制正逐漸成為研究熱點(diǎn)［27-28］，橡膠樹生長發(fā)育過程中經(jīng)常遇到干旱、寒害和病蟲害侵染等脅迫。研究發(fā)現(xiàn)，干旱會誘導(dǎo)橡膠樹葉片產(chǎn)生活性氧，進(jìn)而導(dǎo)致活性氧淬滅酶基因表達(dá)和活性增加。干旱處理3～5 d是橡膠樹生理反應(yīng)的關(guān)鍵時期。本試驗中核糖體蛋白HbRPL14基因受干旱上調(diào)表達(dá)，其在第3天表達(dá)豐度最高，說明其同其他活性氧淬滅酶一起參與了橡膠樹抗旱生理反應(yīng)。隨后，由于干旱的加重，導(dǎo)致其基因表達(dá)持續(xù)下降，機(jī)械傷害和白粉菌侵染亦會導(dǎo)致葉片中活性氧含量上升。研究顯示橡膠樹核糖體蛋白HbRPL14基因參與抗逆調(diào)控機(jī)制。

［1］ 王立豐，王紀(jì)坤，謝貴水.巴西橡膠樹抗旱機(jī)制研究進(jìn)展［J］.熱帶作物學(xué)報，2015，36（2）：426-431.

［2］ 王立豐，吳紹華，田維敏.巴西橡膠樹抗寒機(jī)制研究進(jìn)展［J］.熱帶作物學(xué)報，2012，37（7）：1320-1325.

［3］ Fung S，Nishimura T，Sasarman F，et al.The conserved interaction of C7orf30 with MRPL14 promotes biogenesis of the mitochondrial large ribosomal subunit and mitochondrial translation［J］.Mol Biol Cell，2013，24（3）：184-193.

［4］ 楊品紅，王志陶，王志勇.核糖體的結(jié)構(gòu)與功能研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，36（6）：3184-3189.

［5］ 吳曉華，劉望夷.核糖體的結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展［J］.生命的化學(xué)（中國生物化學(xué)會通訊），1996，16（3）：1-4.

［6］ 明鎮(zhèn)寰.核糖體結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展［J］.浙江大學(xué)學(xué)報（理學(xué)版），2001，28（1）：67-71.

［7］ 范艷榮，劉瑩，張飛云.擬南芥RPS14基因的克隆表達(dá)及功能初步研究［J］.生物技術(shù)通報，2013（1）：73-77.

［8］ 王艷楓，李霞，秦艷杰.刺參核糖體蛋白L17基因（RPL17）全長cDNA克隆及組織表達(dá)［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2013，21（5）：562-569.

［9］ 鄒智，楊禮富.巴西橡膠樹線粒體50S核糖體蛋白L21 cDNA的克隆與分析［J］.生物技術(shù)通報，2011（3）：100-104.

［10］ Behnen P，Davis E，Delaney E，et al.Calcium-dependent interaction of calmodulin with human 80S ribosomes and polyribosomes［J］.Biochemistry，2012，51（34）：6718-6727.

［11］ Maisnier-Patin S，Paulander W，Pennhag A，et al. Compensatory evolution reveals functional interactions between ribosomal proteins S12，L14 and L19［J］.JMol Biol，2007，366（1）：207-215.

［12］ Qin B，Zheng F，Zhang Y.Molecular cloning and characterization of a Mlo gene in rubber tree（Hevea brasiliensis）［J］.Journal of Plant Physiology，2015，175：78-85.

［13］ 覃碧，王萌，林雨見，等.巴西橡膠樹HbMlo9基因克隆及其序列特征分析［J］.熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，33（8）：47-52.

［14］ Wang L F.Physiological and molecular responses to drought stress in rubber tree（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）［J］.Plant Physiol Biochem，2014，83：243-249.

［15］ Wang L F，Wang M，Zhang Y.Effects of powderymildew infection on chloroplast and mitochondrial functions in rubber tree［J］.Tropical Plant Pathology，2014，39（3）：242-250.

［16］ Tischendorf GW，Zeichhardt H，Stoffler G.Determination of the location of proteins L14，L17，L18，L19，L22，L23 on the surface of the 5oS ribosomal subunit of Escherichia coli by immune electron microscopy［J］. Mol Gen Genet，1974，134（3）：187-208.

［17］ Leader D P，Coia A A.The phosphorylation of ribosomal proteins L14 and S3 in Krebs II ascites cells［J］. Biochim Biophys Acta，1978，519（1）：223-224.

［18］ Morinaga T，F(xiàn)unatsu G，F(xiàn)unatsu M.Primary structure of protein L14 isolated from Escherichia coli ribosomes［J］.FEBSLett，1978，91（1）：74-77.

［19］ Tsurugi K，Collatz E，Todokoro K，et al.Isolation of eukaryotic ribosomal proteins.Purification and characterization of the 60 S ribosomal subunit proteins La，Lb，Lf，P1，P2，L13’，L14，L18’，L20，and L38［J］.JBiol Chem，1978，253（3）：946-955.

［20］ Markmann-Mulisch U，Subramanian A R.Nucleotide sequence and linkagemap position of the genes for ribosomal proteins L14 and S8 in themaize chloroplast genome［J］.Eur JBiochem，1988，170（3）：507-514.

［21］ Lou JK，Cruz F D，Wu M.Nucleotide sequence of the chloroplast ribosomal protein gene L14 in Chlamydomonas reinhardtii［J］.Nucleic Acids Res，1989，17（9）：3587.

［22］ Mattheakis L，Vu L，Sor F，et al.Retroregulation of the synthesis of ribosomal proteins L14 and L24 by feedback repressor S8 in Escherichia coli［J］.Proc Natl Acad Sci U SA，1989，86（2）：448-452.

［23］ Beccari E，Mazzetti P，Mileo A，et al.Sequences coding for the ribosomal protein L14 in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis；homologies in the 5＇untranslated region are shared with other r-protein mRNAs［J］.Nucleic Acids Res，1986，14（19）：7633-7646.

［24］ Beccari E，Mazzetti P.The nucleotide sequence of the ribosomal protein L14 gene of Xenopus laevis［J］.Nucleic Acids Res，1987，15（4）：1870-1872.

［25］ Shigeta T，Yasuda D，Mori T，et al.Characterization of brassinosteroid-regulated proteins in a nuclear-enriched fraction of Arabidopsis suspension-cultured cells［J］. Plant Physiology and Biochemistry，2011，49（9）：985-995.

［26］ Cao S，Xu W，Zhang N，et al.A mitochondria-dependent pathwaymediates the apoptosis ofGSE-induced yeast［J］.PLoSONE，2012，7（3）：e32943.

［27］ H?user R，Pech M，Kijek J，et al.RsfA（YbeB）proteins are conserved ribosomal silencing factors［J］. PLoSGenetics，2012，8（7）：e1002815.

［28］ Meijer IM J，van Rotterdam W，van Zoelen E J J，et al.Cbl and Itch binding sites in ERBB4 CYT-1 and CYT-2 mediate K48-and K63-polyubiquitination，respectively［J］.Cellular Signalling，2013，25（2）：470-478.

（責(zé)任編輯 張 坤）

Stress Responsive Mechanisms of Ribosomal Protein HbRPL14 Gene in Rubber Tree（Hevea brasiliensis）

Wang Lifeng，Wang Jikun，An Feng，Xie Guishui
（Danzhou Investigation＆Experiment Station of Tropical Crops ofMinistry of Agriculture，Rubber Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Danzhou Hainan 571737，China）

In order to study the mechanism of ribosomal protein of rubber tree in stress response，HbRPL14 gene was cloned from leaves of the rubber tree CATAS7-33-97，characteristics of bioinformatics and gene expression were analyzed.Tissue analysis showed that its coding area contained specific Ribosomal＿L14 superfamily domain.The expression was highest in latex，flower and leaf，while not expressed in bark.Q-PCR analysis showed that drought，mechanicalwounding and powderymildew infection up-regulated HbRPL14 expression at significantly levels.These suggested that HbRPL14 was inducted by stress environment，through increase the ribosomal protein synthesis level，play roles in physiological and molecular stress resistance in rubber tree.

Hevea brasiliensis；drought；ribosomal protein；HbRPL14；gene；stress response

S718.46

A

2095-1914（2016）02-0067-05

10.11929/j.issn.2095-1914.2016.02.011

2015-07-09

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助（CARS-34-GW5）；國家自然科學(xué)基金（31270643）資助；海南省自然科學(xué)基金（20153135）資助；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項資助（1630022015013）。

第1作者：王立豐（1975—），男，博士，副研究員。研究方向：橡膠樹逆境生理與分子生物學(xué)。Email：lfngwang@yahoo.com。

謝貴水（1967—），男，博士，研究員。研究方向：橡膠樹生態(tài)學(xué)。Email：xie23300459@163.com。