鄧春艷，　張國(guó)超，　鄧紹平，　任莉莉，　蔣錦杏，　俞麗娜，　齊　暉，　李富榮

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/深圳市人民醫(yī)院干細(xì)胞與細(xì)胞治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東 深圳 518020)

?

B淋巴細(xì)胞在抗CD45RB 抗體誘導(dǎo)的移植免疫耐受中的作用*

鄧春艷，張國(guó)超，鄧紹平，任莉莉，蔣錦杏，俞麗娜，齊暉，李富榮△

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/深圳市人民醫(yī)院干細(xì)胞與細(xì)胞治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東 深圳 518020)

[摘要]目的： 探討B(tài)淋巴細(xì)胞在抗CD45RB抗體誘導(dǎo)的移植免疫耐受中的作用。方法: 抗CD45RB抗體對(duì)BALB/c裸鼠進(jìn)行預(yù)處理后制備脾臟單細(xì)胞懸液，與BALB/c小鼠T淋巴細(xì)胞和C57BL/6小鼠脾細(xì)胞混合培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)分析Th1、Th2、Treg和Tm淋巴細(xì)胞。以B6.μMT-/-小鼠為受體、BALB/c小鼠為供體建立皮膚移植模型，移植后向受體鼠腹腔注射抗CD45RB 單抗，監(jiān)測(cè)脾淋巴細(xì)胞 CD3+CD45RBhi細(xì)胞比例。在混合淋巴培養(yǎng)過(guò)程中加入抗 CD45RB單抗，分離 B 細(xì)胞，建立以BALB/c 小鼠為供體、B6.μMT-/-小鼠為受體的心臟移植模型，通過(guò)尾靜脈注射B 細(xì)胞給 B6.μMT-/-小鼠，觀察受體鼠生存期和B細(xì)胞分布。結(jié)果: 在裸鼠體內(nèi)用抗 CD45RB 抗體處理過(guò)的 B 淋巴細(xì)胞，與 T 淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí)，可使Treg和Th2 淋巴細(xì)胞比例明顯升高，Th1淋巴細(xì)胞的比例明顯下降，Tm細(xì)胞無(wú)明顯變化。在體內(nèi)B淋巴細(xì)胞缺失的情況下，抗 CD45RB 抗體依然能夠降低 T 細(xì)胞表面 CD45RB 的表達(dá)，與對(duì)照組B淋巴細(xì)胞存在組相比，抗 CD45RB 抗體對(duì) T 淋巴細(xì)胞表面 CD45RB 下調(diào)更為快速，但最終CD3+CD45RBhiT 細(xì)胞比例無(wú)明顯變化。體外抗 CD45RB 抗體處理過(guò)的B淋巴細(xì)胞可以延長(zhǎng)受體鼠的生存時(shí)間。B6.μMT-/-鼠在接受抗CD45RB抗體處理的B細(xì)胞并進(jìn)行同種異體心臟移植后，B細(xì)胞可向胸腺遷移。結(jié)論: 在抗CD45RB抗體誘導(dǎo)的免疫耐受中，B淋巴細(xì)胞可能通過(guò)介導(dǎo)各T淋巴細(xì)胞亞群比例發(fā)揮著重要作用，且在中樞耐受中也起到一定作用，但是僅靠B淋巴細(xì)胞無(wú)法形成完全耐受。

[關(guān)鍵詞]CD45RB抗體； 移植； 免疫耐受

CD45分子是一種廣泛地表達(dá)在造血系細(xì)胞如T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等表面的跨膜糖蛋白，是細(xì)胞膜上信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子，在淋巴細(xì)胞的發(fā)育成熟、功能調(diào)節(jié)及信號(hào)傳遞中具有重要意義。CD45RB是CD45的一種異構(gòu)體，主要表達(dá)在 T、B、DC 細(xì)胞表面。大量實(shí)驗(yàn)證明針對(duì)CD45RB的單克隆抗體能夠在同種異體移植模型中誘導(dǎo)移植物長(zhǎng)期存活，并在受體體內(nèi)形成特異性的免疫耐受[1-5]。目前針對(duì)抗CD45RB抗體誘導(dǎo)的免疫耐受調(diào)節(jié)機(jī)制的研究大多集中在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)功能。

近年的研究發(fā)現(xiàn)在CD45RB單抗誘導(dǎo)的移植免疫耐受中必須有宿主B淋巴細(xì)胞的參與[6-7]，但相關(guān)作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究在B細(xì)胞存在或缺失狀態(tài)下，抗CD45RB 抗體在體內(nèi)外對(duì)T細(xì)胞的作用及誘導(dǎo)移植免疫耐受的影響等，闡述B淋巴細(xì)胞在抗 CD45RB抗體誘導(dǎo)的移植免疫耐受中可能發(fā)揮的作用機(jī)制。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

近交系BABL/c小鼠(6～8周齡)，雌雄不限，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；近交系雌性C57BL/6小鼠(6～8周齡)及雄性BABL/c裸鼠購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心； B6.μMT-/-鼠(B細(xì)胞缺失，C57BL/6同源, 6～8周齡)，雌雄各半，購(gòu)自Jackson實(shí)驗(yàn)室。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在深圳市疾病控制中心 (SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)完成，所用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

2主要試劑

抗CD45RB單克隆抗體購(gòu)自BioXcell；尼龍柱購(gòu)自Wako；抗CD3-PECY5、CD19-PE、CD4-PECY5、CD25-Alexa Fluro、CD127-PE、 CD8-FITC、CD44-PE、CD62L-FITC、CD45RB-FITC、IL-4-PE、IFN-γ-PE及相應(yīng)的同型對(duì)照等流式抗體購(gòu)自eBioscience；流式破膜劑購(gòu)自Beckman；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；絲裂霉素、PMA、ionomycin等購(gòu)自Sigma；DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Thermo;胎牛血清購(gòu)自HyClone。

3主要方法

3.1抗CD45RB抗體對(duì)BALB/c裸鼠進(jìn)行預(yù)處理將BALB/c裸鼠分為2組，每組各5只。 A 組(n=5)在 0、1、3、5、7 d分別腹腔注射100 μL濃度為1 g/L的抗CD45RB單抗;B組(n=5)在0、1、3、5、7 d腹腔注射 100 μL 生理鹽水，7 d后待用。

3.2抗CD45RB抗體預(yù)處理的B淋巴細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群的作用預(yù)處理的BALB/c裸鼠，無(wú)菌取脾臟制備脾淋巴細(xì)胞懸液，采用尼龍柱分離法分離B淋巴細(xì)胞備用。分別以抗CD3-PEcy和CD19-PE標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+T細(xì)胞純度>90%,CD19+B細(xì)胞>90%，將提取的C57BL/6小鼠脾淋巴細(xì)胞與絲裂霉素C共孵育后作為刺激細(xì)胞。將3 種細(xì)胞按1∶2∶1的比例加至6孔板混合培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組：BALB/c小鼠T淋巴細(xì)胞+B淋巴細(xì)胞(來(lái)自抗CD45RB抗體預(yù)處理BALB/c裸鼠)+C57BL/6脾淋巴細(xì)胞；對(duì)照組：BALB/c小鼠T淋巴細(xì)胞+B淋巴細(xì)胞(來(lái)自生理鹽水預(yù)處理BALB/c裸鼠)+C57BL/6脾淋巴細(xì)胞。

共培養(yǎng)0、1、3、5、7 d時(shí)每組取3個(gè)復(fù)孔分別收獲懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群包括Treg(CD4+CD25+CD127-)、Th1(CD3+CD8-IFN-γ+)、Th2(CD3+CD8-IL-4+)和Tm(CD4+CD62L-CD44hi)。取待檢測(cè)細(xì)胞(1×106)于試管中，分別加入抗體及相應(yīng)同型對(duì)照進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色。IL-4、IFN-γ等細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè)需先經(jīng)過(guò)PMA及BFA刺激，染色前采用破膜劑進(jìn)行破膜處理。孵育后流式細(xì)胞儀(FACSC Canto Ⅱ，Beckton Dickinson)分別進(jìn)行檢測(cè)。

3.3抗CD45RB抗體對(duì)B細(xì)胞缺餡鼠CD3+CD45RBhiT細(xì)胞的影響取BALB/c小鼠耳背部皮膚移植到B6.μMT-/-或C57BL/6小鼠背部，移植方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行[8]。實(shí)驗(yàn)按照隨機(jī)對(duì)照原則分為4組，每組受體鼠24只。A組(實(shí)驗(yàn)組)和B組均為B6.μMT-/-鼠移植 BALB/c 鼠耳背皮膚； C組和D組均為C57BL/6鼠移植 BALB/c鼠耳背皮膚。移植后0、1、3、5、7 d，分別向 A、C 組受體鼠腹腔注射100 μL濃度為1 g/L的抗 CD45RB 單抗，B、D 組腹腔注射 100 μL 生理鹽水。每組分別在腹腔注射后0、1、3、5、7、9 d取4只受體鼠脾臟，制備單細(xì)胞懸液，同上方法，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+CD45RBhi的百分率。

3.4抗CD45RB抗體處理的B淋巴細(xì)胞在同種異體心臟移植中誘導(dǎo)耐受的作用取8周齡雌性C57BL/6小鼠和8周齡雌性BALB/c小鼠，無(wú)菌取脾制成單細(xì)胞懸液。將C57BL/6小鼠脾淋巴細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，BALB/c小鼠脾淋巴細(xì)胞用絲裂霉素C處理后作為刺激細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在0、1、3、5、7 d分別加入1 g/L的抗CD45RB抗體10 μg，對(duì)照組加入PBS 10 μL。將混合培養(yǎng)淋巴細(xì)胞在第9天經(jīng)尼龍柱法分離B淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度2.5×1010/L。B6.μMT-/-鼠經(jīng)尾靜脈注射分別來(lái)自實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的5×106B細(xì)胞后作為受體，BALB/c小鼠作為供體開(kāi)始行同種異體的心臟移植，移植方法見(jiàn)文獻(xiàn)[9]。每組小鼠各6只，每天通過(guò)視、觸診觀察供心的搏動(dòng)情況。以供心搏動(dòng)有力，且小鼠存活72 h以上視為移植成功，記錄移植小鼠的生存時(shí)間。

3.5B細(xì)胞經(jīng)抗CD45RB抗體處理后向胸腺遷移狀況的檢測(cè)按照隨機(jī)數(shù)字表法將60只B6.μMT-/-分為3組，每組20只。正常的B6小鼠 B細(xì)胞約5×106經(jīng)抗CD45RB抗體10 μg處理，CFSE標(biāo)記上述細(xì)胞后通過(guò)尾靜脈向?qū)嶒?yàn)組和 B6.μMT-/-鼠注射，將 BALB/c 小鼠心臟移植到B6.μMT-/-鼠，方法同前。以接受不經(jīng)抗CD45RB抗體處理組的B細(xì)胞移植受體鼠作為對(duì)照組1，接受抗CD45RB抗體處理組的B細(xì)胞但不做心臟移植的 B6.μMT-/-鼠為對(duì)照組2。在1、3、5、7、10 d每組取4只小鼠胸腺制備單細(xì)胞懸液，通過(guò)流式細(xì)胞儀監(jiān)控CD19+CFSE+B細(xì)胞遷移到胸腺的程度。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有結(jié)果以 SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，統(tǒng)計(jì)方法使用兩樣本t檢驗(yàn)和析因設(shè)計(jì)的方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn),生存期采取log-rank檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1抗CD45RB抗體處理過(guò)的B細(xì)胞在體外對(duì)T 細(xì)胞亞群的影響

為了觀察B淋巴細(xì)胞在抗CD45RB抗體誘導(dǎo)免疫耐受中對(duì) T 細(xì)胞亞群的影響，我們將來(lái)自抗CD45RB抗體注射后BALB/c裸鼠的B細(xì)胞與BALB/c小鼠的T細(xì)胞一起作為反應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)?；旌狭馨团囵B(yǎng)7 d內(nèi)，2組調(diào)節(jié)性Treg細(xì)胞比例均呈逐漸上升趨勢(shì)，但實(shí)驗(yàn)組中上升幅度明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；2組Tm細(xì)胞比例呈逐漸上升趨勢(shì)，但上升幅度無(wú)明顯差別；2組Th1細(xì)胞陽(yáng)性率均呈逐漸上升趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組升幅明顯低于對(duì)照組；Th2細(xì)胞陽(yáng)性率也呈逐漸上升趨勢(shì)，但實(shí)驗(yàn)組升幅明顯高于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組Th1/Th2較對(duì)照組降低(P<0.05),見(jiàn)圖1。

2抗CD45RB抗體對(duì)B細(xì)胞缺陷鼠外周成熟T細(xì)胞的影響

為了解抗CD45RB抗體在B細(xì)胞缺失的情況下，對(duì)同種異體移植模型外周T細(xì)胞的影響，我們選取體內(nèi)B細(xì)胞缺陷小鼠B6.μMT-/-鼠作為受體進(jìn)行同種異體皮膚移植，并與非B細(xì)胞缺陷鼠進(jìn)行比較。A 組B6.μMT-/-鼠注射抗CD45RB抗體后，第1天的CD3+CD45RBhi細(xì)胞在CD3+細(xì)胞中的比例即降到 40%左右，繼續(xù)注射抗體無(wú)法使其比例再降低。B組B6.μMT-/-鼠未使用抗CD45RB抗體，CD3+CD45RBhi的比例隨時(shí)間幾乎沒(méi)有變化。C 組 C57BL/6 鼠在注射抗 CD45RB抗體后，CD3+CD45RBhi的比例隨時(shí)間逐漸降低，在第9天降到了和B細(xì)胞缺陷鼠A組相同的水平(P<0.05)。D組C57BL/6鼠在移植皮膚之后注射生理鹽水，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，CD3+CD45RBhi的比例呈明顯升高，見(jiàn)圖1。

3體外誘導(dǎo)耐受的B細(xì)胞對(duì)心臟移植受體鼠生存期的影響

為了觀察抗CD45RB抗體對(duì)外周耐受的誘導(dǎo)是否僅僅依靠B細(xì)胞就可以完成，我們?cè)隗w外用抗CD45RB抗體誘導(dǎo)B細(xì)胞的耐受，將誘導(dǎo)耐受后的B細(xì)胞靜脈注入B細(xì)胞缺陷鼠體內(nèi)，觀察心臟移植的生存期。在體外混合培養(yǎng)6 h后觀察細(xì)胞形態(tài)，可見(jiàn)未加抗體組的淋巴細(xì)胞分布較均勻，無(wú)細(xì)胞成團(tuán)現(xiàn)象。而加入抗體組的細(xì)胞大部分形成大小不等的團(tuán)狀分布，散在單個(gè)分布細(xì)胞較少。將抗CD45RB抗體處理過(guò)的C57BL/6小鼠B細(xì)胞分離出來(lái)，經(jīng)尾靜脈注射給同種異體心臟移植受體B細(xì)胞缺陷B6.μMT-/-鼠能延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間。實(shí)驗(yàn)組移植心臟平均存活時(shí)間為(14.3±3.5)d，對(duì)照組移植心臟平均存活時(shí)間為(4.2±1.2)d。經(jīng)log-rank檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組移植心臟存活時(shí)間較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 1.The influence of anti-CD45RB mAb-disposed B cells on T-cell subgroups. Mean±SD.n=3～4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsgroup C.

圖1抗CD45RB抗體處理過(guò)的B細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞亞群的影響

Figure 2.The influence ofinvitroinduced tolerance B cells on the lifetime of rats after allogeneic heart transplantation. A: the cells in mixed lymphocyte culture without anti-CD45RB mAb (×200); B: the cells in mixed lymphocyte culture with anti-CD45RB mAb (×200); C: the survival curve after transplantation (n=6).

圖2體外誘導(dǎo)耐受的 B 細(xì)胞對(duì)同種異體心臟移植受體鼠生存期的影響

4B細(xì)胞經(jīng)抗CD45RB抗體處理后向胸腺遷移狀況

實(shí)驗(yàn)組于第5天在胸腺中開(kāi)始檢測(cè)到少量經(jīng) CFSE 標(biāo)記過(guò)的B細(xì)胞[(3.13±0.53) %]，隨后逐漸增多，第10天達(dá)到約(8.32±1.21) %；對(duì)照組1中B細(xì)胞未經(jīng)過(guò)抗CD45RB抗體處理，胸腺中未出現(xiàn)明顯的CD19+CFSE+B細(xì)胞；對(duì)照組2雖然接受了抗CD45RB抗體處理的B細(xì)胞，但未進(jìn)行移植，前期胸腺中未能檢測(cè)到CD19+CFSE+B細(xì)胞，直到第10天，在胸腺中僅檢測(cè)到微量B細(xì)胞[(2.22±0.13) %],見(jiàn)圖3、表1。

Figure 3.The migration of B cells treated with anti-CD45RB mAb to the thymus.Control 1: B cells was untreated with anti-CD45RB mAb in the transplantion model; control 2: B cells was treated with anti-CD45RB mAb but without transplantation.

圖3B細(xì)胞經(jīng)抗CD45RB抗體處理后向胸腺遷移狀況

討論

B 細(xì)胞是體內(nèi)數(shù)目最多的抗原提呈細(xì)胞，也是體內(nèi)惟一能產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，但是它在免疫耐受中發(fā)揮的作用仍然是有爭(zhēng)議的，它可能對(duì)免疫排斥具有兩種決然不同的作用。在某些情況下B細(xì)胞會(huì)加速排斥反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞免疫，清除B細(xì)胞可能延長(zhǎng)移植物存活[10-12]。而在另一些研究中，B 細(xì)胞在抗CD45RB抗體耐誘導(dǎo)的耐受中被證明是必須的[6-7, 13]。

表1B細(xì)胞經(jīng)CD45RB抗體處理后向胸腺遷移狀況

Table 1.The migration of B cells treated with anti-CD45RB mAb to the thymus (%. Mean±SD.n=4)

Time(d)Control1Control2Experimental10.91±0.360.88±0.610.86±0.1830.89±0.170.93±0.230.93±0.4151.21±0.260.81±0.183.13±0.53*#71.53±0.230.79±0.336.26±0.71*#100.95±0.112.22±0.138.32±1.21*#

*P<0.05vscontrol 1;#P<0.05vscontrol 2.

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)用抗CD45RB抗體對(duì)裸鼠 B 細(xì)胞進(jìn)行處理，處理后的 B 細(xì)胞在體外能上調(diào)裸鼠體內(nèi)缺少的T細(xì)胞。用抗CD45RB 抗體進(jìn)行處理時(shí)，體內(nèi)B細(xì)胞在缺少胸腺、無(wú)T細(xì)胞和沒(méi)有抗原刺激的情況下，一方面抗CD45RB抗體可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合B細(xì)胞表面CD45RB，從而阻斷活化信號(hào)的傳導(dǎo)，起到抑制增殖的作用；另一方面抗CD45RB抗體可能改變B細(xì)胞表面某些分子的表達(dá)，使B細(xì)胞轉(zhuǎn)變成介于靜息狀態(tài)B細(xì)胞和耐受狀態(tài)B細(xì)胞之間的一種狀態(tài)。當(dāng)把此種B細(xì)胞取出體外，在混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中與T細(xì)胞、抗原刺激相混合時(shí)，這種中間狀態(tài)可能改變B細(xì)胞提呈抗原、與 T 細(xì)胞共刺激等作用，從而使 Th2、Treg 細(xì)胞比率升高，Th1 細(xì)胞比率下降，T 細(xì)胞反應(yīng)朝向耐受的方向發(fā)展。對(duì)Tm細(xì)胞無(wú)明顯影響可能是因?yàn)門 細(xì)胞第一次遇到外界抗原刺激，記憶T細(xì)胞增殖作用占主導(dǎo)地位，而抗CD45RB 抗體處理過(guò)的 B 細(xì)胞對(duì)其增殖的抑制影響被忽略所致。

Blaylock等[14]實(shí)驗(yàn)證實(shí)， 抗CD45RB抗體的免疫調(diào)節(jié)作用與清除外周血中某種特異性 T 細(xì)胞亞群有關(guān)。有研究[15-16]證明抗 CD45RB抗體可改變受體外周血CD45RBhiT細(xì)胞和CD45RBloT細(xì)胞的比值來(lái)誘導(dǎo)耐受，CD45RBloCD4+T能夠表達(dá)調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，分泌細(xì)胞因子IL-4，且具有調(diào)節(jié)作用，而CD45RBhiCD4+T低表達(dá)Foxp3，分泌介導(dǎo)排斥反應(yīng)的Th1類細(xì)胞因子，且具有效應(yīng)細(xì)胞的作用。因此，調(diào)節(jié)性CD45RBloT和效應(yīng)性CD45RBhiT之間平衡的改變對(duì)于CD45RB單抗的免疫功能是至關(guān)重要的。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在B細(xì)胞缺失的情況下，抗CD45RB抗體對(duì)脾內(nèi)CD45RBhiT的減少作用依然存在，只是減少的方式與B細(xì)胞存在的情況下有所不同。B細(xì)胞缺陷鼠皮膚移植注射抗CD45RB抗體后，第1天CD3+CD45RBhi細(xì)胞在CD3+陽(yáng)性細(xì)胞中的比例就降到40%左右，以后再注射抗體都無(wú)法使其比例再降低。而C57BL/6皮膚移植鼠在注射抗CD45RB 抗體后，CD3+CD45RB+的比例隨時(shí)間逐漸降低，在第9天降到了和 B 細(xì)胞缺陷鼠實(shí)驗(yàn)組相同的水平。原因可能是CD45RB廣泛表達(dá)在T、B細(xì)胞表面，在B細(xì)胞存在的情況下，B細(xì)胞能夠和 T 細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)抗CD45RB的結(jié)合位點(diǎn)，不至于使CD45RBhiT細(xì)胞降低過(guò)快。C57BL/6小鼠生理鹽水組CD45RBhiT 細(xì)胞比例稍有增加，而B6.μMT-/-鼠生理鹽水組基本沒(méi)有變化，可能是因?yàn)樵诮邮芸乖碳r(shí)，作為抗原提呈細(xì)胞的B細(xì)胞可上調(diào) T細(xì)胞表面CD45RB分子的表達(dá)，CD45RBhiT細(xì)胞具有效應(yīng)細(xì)胞的作用，從而產(chǎn)生更為強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，在抗CD45RB抗體減少外周CD45RBhiT細(xì)胞的作用中，B細(xì)胞起到一定的作用，但并不是決定性的作用。B細(xì)胞可以使CD45RBhiT細(xì)胞的減少不至于過(guò)快，這也可能是抗CD45RB抗體誘導(dǎo)耐受后，機(jī)體仍對(duì)其它抗原保持正常免疫反應(yīng)的一個(gè)原因。

CD45RB誘導(dǎo)的免疫耐受中，B細(xì)胞起到重要作用，B細(xì)胞的缺失將導(dǎo)致誘導(dǎo)耐受的失敗，但抗CD45RB 抗體對(duì)耐受的誘導(dǎo)僅僅依靠B細(xì)胞能形成嗎？本實(shí)驗(yàn)在將體外誘導(dǎo)耐受的B細(xì)胞注入到B細(xì)胞缺陷鼠體內(nèi)重建其免疫系統(tǒng)，可延長(zhǎng)移植物的生存期，但不能誘導(dǎo)完全免疫耐受。這也說(shuō)明了在抗CD45RB誘導(dǎo)耐受中B細(xì)胞的耐受并不能誘導(dǎo)整個(gè)機(jī)體的耐受，還需要T、DC等細(xì)胞的參與。在體外制備耐受B細(xì)胞時(shí)，我們注意到在混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中加入抗CD45RB抗體后，B細(xì)胞聚集成團(tuán)生長(zhǎng)，單個(gè)散在細(xì)胞較少。其原因一方面可能是淋巴細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性地與抗CD45RB抗體結(jié)合，導(dǎo)致了一個(gè)抗CD45RB分子與多個(gè)淋巴細(xì)胞結(jié)合的現(xiàn)象。另一方面可能是細(xì)胞表面的CD54即細(xì)胞間黏附分子-1的表達(dá)上調(diào)，這類分子的上調(diào)直接影響到了細(xì)胞間的接觸，導(dǎo)致了細(xì)胞的成團(tuán)分布。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)應(yīng)用抗 CD45RB加速了同種異體移植模型中B細(xì)胞向胸腺的遷移，進(jìn)而提呈移植物特異性抗原給胸腺，介導(dǎo)了胸腺對(duì)能與移植物特異性抗原結(jié)合的T細(xì)胞的克隆清除，從而導(dǎo)致了中樞耐受，證實(shí)了在抗CD45RB抗體所介導(dǎo)的中樞耐受中需要宿主B細(xì)胞的參與。

綜上所述，抗CD45RB抗體誘導(dǎo)的免疫耐受中，B細(xì)胞發(fā)揮著重要作用，但是，僅僅依靠B細(xì)胞無(wú)法形成完全耐受。免疫耐受的誘導(dǎo)是一個(gè)多種機(jī)制參與的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程。我們需要對(duì)抗CD45RB抗體誘導(dǎo)的免疫耐受調(diào)節(jié)規(guī)律進(jìn)行更深入的研究，才能夠更好地發(fā)掘抗CD45RB抗體作為新的免疫抑制藥物在臨床移植中的應(yīng)用潛力。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Camirand G, Rousseau J, Ducharme ME, et al. Novel Duchenne muscular dystrophy treatment through myoblast transplantation tolerance with anti-CD45RB, anti-CD154 and mixed chimerism[J]. Am J Transplant, 2004, 4(8):1255-1265.

[2]Lee EN, Kim EY, Lee J, et al. Changes in expression of T-cell activation-related molecules and cytokines during tolerance induction in an allogeneic skin transplantation murine model[J]. Transplant Proc, 2004, 36(8): 2425-2428.

[3]Visser L, Poppema S, de Haan B, et al. Prolonged survival of rat islet xenografts in mice after CD45RB monotherapy[J]. Transplantation, 2004, 77(3):386-391.

[4]Rayat GR, Gill RG. Indefinite survival of neonatal porcine islet xenografts by simultaneous targeting of LFA-1 and CD154 or CD45RB[J]. Diabetes, 2005, 54(2):443-451.

[5]Zhong T, Liu Y, Jiang J, et al. Long-term limb allograft survival using a short course of anti-CD45RB monoclonal antibody, LF 15-0195, and rapamycin in a mouse model[J]. Transplantation, 2007, 84(12):1636-1643.

[6]Deng S, Moore DJ, Huang X, et al. Cutting edge: transplant tolerance induced by anti-CD45RB requires B lymphocytes[J]. J Immunol, 2007, 178(10): 6028-6032.

[7]Lee KM, Kim JI, Stott R, et al. Anti-CD45RB/anti-TIM-1-induced tolerance requires regulatory B cells[J]. Am J Transplant, 2012, 12(8):2072-2078.

[8]沈媛，曾耀英，肇靜嫻. 雌激素處理DCs在誘導(dǎo)小鼠同種皮膚移植免疫耐受中的作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志，2008, 24(10):2020-2024.

[9]Ono K, Lindsey ES. Improved technique of heart transplantation in rats[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 1969, 57(2):225-229.

[10]Colvin RB, Smith RN. Antibody-mediated organ-allograft rejection[J]. Nat Rev Immunol, 2005, 5(10):807-817.

[11]Noorchashm H, Reed AJ, Rostami SY, et al. B cell-mediated antigen presentation is required for the pathogenesis of acute cardiac allograft rejection[J]. J Immunol, 2006,177(11):7715-7722.

[12]Kelishadi SS, Azimzadeh AM, Zhang T, et al. Preemptive CD20+B cell depletion attenuates cardiac allograft vasculopathy in cyclosporine-treated monkeys[J]. J Clin Invest, 2010, 120(4):1275-1284.

[13]Huang X, Moore DJ, Mohiuddin M, et al. Inhibition of ICAM-1/LFA-1 interactions prevents B-cell-dependent anti-CD45RB-induced transplantation tolerance[J]. Transplantation, 2008, 85(5):675-680.

[14]Blaylock MG, Sexton DW, Walsh GM. Ligation of CD45 and the isoforms CD45RA and CD45RB accelerates the rate of constitutive apoptosis in human eosinophils[J]. J Allergy Clin Immunol, 1999, 104(6):1244-1250.

[15]Luke PP, Deng JP, Lian D, et al. Prolongation of allograft survival by administration of anti-CD45RB monoclonal antibody is due to alteration of CD45RBhi: CD45RBloT-cell proportions[J]. Am J Transplant, 2006, 6(9): 2023-2034.

[16]Chen G, Luke PP, Yang H, et al. Anti-CD45RB monoclonal antibody prolongs renal allograft survival in cynomolgus monkeys[J]. Am J Transplant, 2007, 7(1): 27-37.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Role of B cells in CD45RB antibody-induced transplantation immune tolerance

DENG Chun-yan, ZHANG Guo-chao, DENG Shao-ping, REN Li-li, JIANG Jin-xing, YU Li-na, QI Hui, LI Fu-rong

(TheKeyLaboratoryofStemCellandCellularTherapy,ShenzhenPeople’sHospital,TheSecondClinicalMedicalCollege,JinanUniversity,Shenzhen518020,China.E-mail:frli62@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of B cells in CD45RB antibody-induced transplantation immune tolerance. METHODS: Single cell suspension was made from the spleen of BALB/c nude mice disposed by CD45RB antibody, then mixed cultured with T cells of BALB/c mice and spleen cells of C57BL/6 mice. The Th1, Th2, Treg and Tm cells were monitored by flow cytometry during the culture process. The skin graft model was set up with B6.μMT-/-mice as receptors and BALB/c mice as donors. CD45RB antibody was intraperitoneally injected into the receptors after transplantation and then CD3+CD45RBhicells were detected by flow cytometry. In another mixed lymphocyte culture, CD45RB antibody was added, and then B cells were isolated and injected into B6.μMT-/-mice through the tail vein. The heart transplantation model was established with B6.μMT-/-mice as receptors and BALB/c mice as donors， and then the survival and the migration of B cells to the thymus were observed. RESULTS: When T lymphocytes were co-cultured with B lymphocytes treated with anti-CD45RB monoclonal antibody (mAb) in vivo, the percentages of Th2 and Treg cells were up-regulated and Th1 cells were down-regulated, but Tm cells were not altered as compared with the control. In vivo without B lymphocytes, anti-CD45RB mAb also down-regulated the expression of CD45RB in T lymphocytes. The reduction was faster and the percentage of CD3+CD45RBhiT cells was not altered as compared with the control. The B lymphocytes treated with anti-CD45RB mAb in vitro prolonged the lifetime of receptor in heart transplantation model but failed to induce complete tolerance. After recieving B cells treated with anti-CD45RB mAb and allogeneic heart transplantation, B cells migrated to the thymus in B6.μMT-/-mice. CONCLUSION: B lymphocytes play a definite role in the transplantation immune tolerance induced by anti-CD45RB mAb through their affection on T-cell subgroups and also in the central tolerance. However, the induction of immune tolerance can not only rely on B cells.

[KEY WORDS]CD45RB antibody; Transplantation; Immune tolerance

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.017

[中圖分類號(hào)]R392.4； R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel： 0755-22942450； E-mail: frli62@163.com

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家973前期專項(xiàng)(No.2007CB516811)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30772042)；深圳市科技計(jì)劃(No.201001005)

[收稿日期]2015- 09- 01[修回日期] 2016- 01- 26

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)03- 0492- 07

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net