桃子璽，　范挽亭，　李　娟，　黃世光

(暨南大學醫(yī)學院口腔醫(yī)學系，廣東 廣州 510632)

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TLR2和TLR4在人慢性根尖周病組織肥大細胞上的表達*

桃子璽▲，范挽亭▲，李娟，黃世光△

(暨南大學醫(yī)學院口腔醫(yī)學系，廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 觀察人不同類型慢性根尖周病組織中肥大細胞(mast cells, MCs)上Toll樣受體2(Toll-like receptor 2, TLR2)和TLR4的表達情況，探討TLR2-類胰蛋白酶(tryptase)和TLR4-tryptase雙陽性MCs在慢性根尖周疾病發(fā)病機制中的作用。方法: 將60例自愿參與本研究的受試者按根尖周病分類標準分為3組：(1)正常對照組；(2)根尖周肉芽腫組；(3)根尖周囊腫組。將根尖周組織標本置于4%甲醛固定液中浸泡48 h以上，制作連續(xù)組織切片。HE染色，光學顯微鏡下觀察各組根尖周標本的組織學變化；免疫熒光雙染色后于熒光顯微鏡下觀察TLR2-tryptase和TLR4-tryptase雙陽性MCs在根尖周組織中的分布情況。結(jié)果: 根尖周病變組TLR2-tryptase和TLR4-tryptase雙陽性MCs比正常牙周膜組明顯增多(P<0.01)；與根尖肉芽腫組相比，根尖囊腫組TLR2-tryptase及TLR4-tryptase雙陽性MCs數(shù)目明顯增高(P<0.01)。結(jié)論: TLR2及TLR4在慢性根尖周疾病組織中MCs上表達增加，提示TLR2-tryptase及TLR4-tryptase雙陽性MCs可能參與慢性根尖周病發(fā)病過程的免疫調(diào)節(jié)。

[關鍵詞]慢性根尖周??； 肥大細胞； Toll樣受體2； Toll樣受體4

慢性根尖周疾病是口腔常見疾病之一，主要由來源于感染根管的細菌及其代謝產(chǎn)物擴散至根尖周組織所致，表現(xiàn)為根尖周組織的炎癥與骨吸收。傳統(tǒng)認為，肥大細胞(mast cells, MCs)是過敏性炎癥反應的主要效應細胞，近年的研究發(fā)現(xiàn)， MCs作為效應和調(diào)節(jié)性免疫細胞在固有免疫的建立和適應性免疫反應中發(fā)揮重要作用[1]。我們前期研究結(jié)果顯示MCs的募集和脫顆粒、肥大細胞Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)與牙周病及其炎癥程度密切相關，肥大細胞轉(zhuǎn)化生長因子β和干細胞因子在慢性根尖周疾病致病過程，尤其在根尖周囊腫的纖維組織形成中發(fā)揮重要作用；提示MCs在牙周病的發(fā)病及病理過程中起重要作用，SCF-tryptase及TGF-β-tryptase雙陽性MCs與慢性周病的炎癥損害有關[2-5]。TLR2和TLR4作為TLRs家族的重要成員，能夠識別各種病原微生物表達的病原識別受體(pathogen recognition receptors, PRRs)，屬于Ⅰ型跨膜蛋白受體[6]，能廣泛識別病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，介導炎癥反應。已有研究證實在人類根尖周病變組織中有TLR2和TLR4表達，提示TLR2和TLR4在機體對病原體免疫識別，以及固有免疫和適應性免疫過程中發(fā)揮著重要作用。目前，關于TLR2和TLR4在MCs上的表達及其在慢性根尖周病發(fā)病機制中作用尚未見報道。本文通過免疫熒光雙染色法，觀察不同類型人慢性根尖周炎組織中MCs上TLR2與TLR4表達情況，探討MCs的TLR2和TLR4在根尖周感染中的作用及機制。

材料和方法

1研究對象

1.1根尖周病例選擇慢性根尖周炎病例選擇2013年7月～2014年6月在暨南大學荔灣口腔教學醫(yī)院就診的15～62歲患者共60例，其中男性27例，(32.0±15.5)歲，女性33例，(30.0±14.2)歲，所有患者均排除患有系統(tǒng)性疾病，就診時為非急性炎癥期，且2個月內(nèi)沒使用過抗生素，所有患者均簽署知情同意書。

1.2分組及取材(1)正常對照(control)組：取自因正畸治療需要拔除的根尖周組織健康且牙根發(fā)育完全的前磨牙的根尖牙周膜組織。納入標準：活髓牙；X線顯示根尖區(qū)未見低密度的透射影；牙周膜光滑連續(xù)且拔牙過程未傷及根尖區(qū)牙周膜；組織學觀察未見毛細血管增生及炎癥細胞浸潤。(2)根尖周肉芽腫(periapical granuloma)組：取自因根尖周病變無法通過非手術方法治愈須行根尖刮治術獲取的根尖周組織。納入標準：非活髓牙；X線顯示患牙的根尖區(qū)有圓形或橢圓形邊界清晰的低密度透射影，直徑≤1 cm；手術過程中發(fā)現(xiàn)根尖區(qū)存有病變實性軟組織；組織學觀察顯示根尖周病變組織為肉芽組織團塊，伴毛細血管增生及大量炎癥細胞浸潤。(3)根尖周囊腫(periapical cyst)組：取自因根尖周病變無法通過非手術方法治愈須行刮治術的根尖周組織。納入標準：非活髓牙；X線顯示患牙的根尖區(qū)有圓形或橢圓形低密度透射影，直徑≥1 cm，邊緣有明顯的白色阻射線；手術過程中發(fā)現(xiàn)根尖區(qū)病變組織為內(nèi)含液體或半固體的囊性組織；組織學觀察顯示根尖周病變組織含大量的膠原纖維，為非角化復層鱗狀上皮完全或部分覆蓋的囊腔或組織。

2實驗方法

2.1組織標本采集、處理與觀察根尖肉芽腫和根尖囊腫標本是在根尖刮治手術時取得的根尖周病變組織。正常對照組標本取自因正畸需要拔除的牙周健康的前磨牙，用無菌刀片將牙周膜從牙根上刮取。樣本取出后立即固定于4%甲醛中浸泡48 h以上，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋，制備成5 μm厚度連續(xù)組織切片。HE染色，光學顯微鏡下觀察各組標本的組織學改變。

2.2TLR2和TLR4陽性MCs免疫熒光雙染色Ⅰ抗: tryptase 抗體(Abcam)，稀釋濃度為1∶200；TLR2和TLR4 抗體(武漢博士德)稀釋濃度為1∶100。Ⅱ抗: 山羊抗鼠IgG(H+L)Alexa Fluor 488 和山羊抗兔IgG(H+L)Alexa Fluor 555(CST)，稀釋濃度為1∶200。DAPI(MP Biomedicals)，稀釋濃度1∶200。組織切片經(jīng)過常規(guī)脫蠟、乙醇復水，檸檬酸鹽緩沖液微波抗原修復、山羊血清封閉，Ⅰ抗孵育，避光條件下Ⅱ抗孵育熒光染色后，立即在熒光顯微鏡下觀察。陰性對照組用PBS代替Ⅰ抗和Ⅱ抗，DAPI核染，立即在熒光顯微鏡下觀察。Tryptase 免疫熒光陽性信號為綠色熒光，TLR2和TLR4信號均顯示紅色熒光，定位于細胞漿或細胞膜，同一視野下tryptase 綠色熒光分別與TLR2和TLR4 紅色熒光重疊后為橘色熒光，DAPI 信號顯示為藍色，定位于細胞核。由2 名病理醫(yī)師于免疫熒光顯微鏡下觀察到MCs 均表達有TLR2 和TLR4，從而對各組實驗標本中TLR2和TLR4陽性MCs 計數(shù)并計算各組TLR2 和TLR4 陽性MCs 密度(cells/mm2)。每張切片在高倍鏡下(×400)選取橘色熒光最多的5個視野進行計數(shù)，計算5個視野中TLR2和TLR4陽性的MCs的密度(cells/mm2)。

3統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0分析處理。各組標本組織中TLR2-tryptase和TLR4-tryptase雙陽性MCs平均密度的比較采用Kruskal-Wallis 檢驗，采用Nemenyi 檢驗進行多重比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1組織學觀察

正常對照組：根尖周牙周膜組織結(jié)構完整，纖維組織豐富，以成纖維細胞為主，未見明顯的炎癥細胞浸潤；根尖肉芽腫組：根尖周牙周膜組織結(jié)構破壞，主要由新生的毛細血管、成纖維細胞和浸潤的中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞和巨噬細胞等炎癥細胞構成，部分病變內(nèi)部見上皮條索及上皮島；根尖周囊腫組：根尖周牙周膜組織結(jié)構破壞，毛細血管擴張，鏡下可見根尖周囊腫組織上皮層表現(xiàn)為細胞間水腫，上皮層下方見大量慢性炎癥細胞浸潤；纖維組織層以膠原纖維為主，未見明顯的炎癥細胞浸潤。同時部分囊壁內(nèi)見含鐵血黃素和膽固醇晶體沉積的梭形間隙，見圖1。

Figure 1.Histology of human periapical tissues(HE staining, ×400). A: healthy control; B: periapical granuloma; C: the epithelial layer of periapical cyst; D: the fibrous tissue area of periapical cyst.

圖1各實驗組組織學觀察

2TLR2陽性MCs免疫熒光雙染色結(jié)果

各組標本組織中TLR2-tryptase雙陽性MCs 免疫熒光雙染色結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，各組標本組織MCs 均表達TLR2。正常對照組：根尖周牙周膜組織中見少量散在分布的TLR2-tryptase雙陽性MCs；根尖肉芽腫組：與正常對照組對比，根尖周組織中可見TLR2-tryptase雙陽性MCs 數(shù)目顯著增多，且MCs 有脫顆?，F(xiàn)象；根尖囊腫組：根尖周病變組織中出現(xiàn)大量的TLR2-tryptase雙陽性MCs，且MCs 伴明顯脫顆粒現(xiàn)象；各組標本組織的陰性對照組均未見TLR2和tryptase陽性表達，可見DAPI核染，見圖3。

各組標本組織中TLR2-tryptase雙陽性MCs密度的比較見圖4，結(jié)果顯示：2組慢性根尖周病組織中TLR2-tryptase雙陽性MCs的數(shù)量較正常對照組明顯增多(P<0.01)；根尖周囊腫組TLR2-tryptase雙陽性MCs的數(shù)量較根尖周肉芽腫組明顯增多(P<0.01)。

各標本組織中TLR2-tryptase雙陽性MCs及脫顆粒MCs密度比較見圖5。與正常對照組相比，2組慢性根尖周病組織中MCs密度及脫顆粒MCs密度顯著上升(P<0.01)，且根尖囊腫組的MCs密度及脫顆粒MCs明顯高于根尖肉芽腫組(P<0.05)。

3TLR4陽性MCs免疫熒光雙染色結(jié)果

各組標本組織中TLR4-tryptase雙陽性MCs 免疫熒光雙染色結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示，各組標本組織MCs 均表達TLR4。正常對照組牙周膜組織中見少量散在分布的TLR4-tryptase雙陽性MCs；根尖肉芽腫組組織中TLR4-tryptase雙陽性MCs數(shù)目顯著增多，且MCs有脫顆粒現(xiàn)象；根尖囊腫組組織中出現(xiàn)大量的TLR4-tryptase雙陽性MCs，且MCs伴明顯脫顆?，F(xiàn)象；各組標本組織的陰性對照組均未見TLR4和tryptase陽性表達，可見DAPI核染，見圖7。

Figure 2.TLR2-tryptase double-positive mast cells in human gingival tissues (double immunofluorescence staining, ×400). Scale bar=50 μm.

圖2各實驗組中TLR2-tryptase雙陽性肥大細胞

Figure 3.Negative control group for TLR2 and tryptase staining (double immunofluorescence staining, ×400). Scale bar=50 μm.

圖3TLR2 和tryptase染色的陰性對照組

Figure 4.The density of TLR2-tryptase positive MCs. Mean±SD.n=20.**P<0.01vshealthy control;##P<0.01vsperiapical granuloma.

圖4各組標本組織中TLR2-tryptase雙陽性肥大細胞密度的比較

各組標本組織中TLR4-tryptase 雙陽性MCs 密度見圖8，結(jié)果顯示：2組慢性根尖周病組織中TLR4-tryptase雙陽性MCs的數(shù)量較正常對照組明顯增多(P<0.01)；根尖周囊腫組TLR4-tryptase雙陽性MCs的數(shù)量較根尖周肉芽腫組明顯增多(P<0.01)。

各標本組織中tryptase陽性MCs及脫顆粒MCs密度比較見圖9。與正常對照組相比，2組慢性根尖周病組織中MCs密度及脫顆粒MCs密度顯著上升(P<0.01)，且根尖囊腫組的MCs密度及脫顆粒MCs明顯高于根尖肉芽腫組(P<0.05)。

討論

目前研究認為，根尖周疾病的發(fā)病與革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌混合感染相關[7]。感染根管的細菌或細菌毒素擴散侵入根尖周組織區(qū)域，啟動機體免疫炎癥反應，產(chǎn)生一系列引起根尖周局部組織損傷的介質(zhì)[8]。根尖周組織抗原提呈細胞(antigen-presenting cells, APCs)通過對病原微生物PRRs進行特異性抗原識別，上調(diào)共刺激分子并分泌細胞因子，從而激活適應性免疫系統(tǒng)[9]。研究顯示，在健康根尖周組織中僅有少量APCs存在；受病原微生物入侵刺激，根尖周組織中APCs的表達明顯增加[7]。

Figure 5.Density of TLR2-tryptase positive MCs and degranulated MCs. Mean±SD.n=20.**P<0.01vshealthy control;#P<0.05vsperiapical granuloma.

圖5各標本組織中TLR2-tryptase雙陽性MCs及脫顆粒MCs密度的比較

MCs是機體固有免疫細胞，參與特殊炎癥反應或機體防御反應，發(fā)揮多種免疫功能[10]。研究證實MCs能表達多種PRRs，包括TLRs。MCs通過其表面的TLRs，如TLR2和TLR4識別廣泛的PAMPs，此過程與其抗菌防御和炎癥反應的進展密切相關[11-12]。MCs可被TLRs激活劑直接激活，合成分泌TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-8等細胞因子；此外，TLRs活化也可引起MCs脫顆粒，釋放組胺、蛋白酶、趨化因子等細胞介質(zhì)。TLR受體信號通路已被證實與FcεRI通路間有交聯(lián)反應，兩者協(xié)同調(diào)節(jié)MCs的功能[13]。Konopka等[14]體外實驗顯示，TLRs和FcεRI同時活化可促使MCs釋放細胞因子。

Figure 6.TLR4-tryptase double-positive mast cells in human gingival tissues (double immunofluorescence staining, ×400). Scale bar=50 μm.

圖6各實驗組中TLR4-tryptase雙陽性肥大細胞

Figure 7.Negative control group for TLR4 and tryptase staining (double immunofluorescence staining, ×400). Scale bar=50 μm.

圖7TLR4T和tryptase染色的陰性對照組

TLRs活化導致多效應分子的釋放，如誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、抗菌肽，起到抑制病原體的作用[15]。TLR2能與TLR1或TLR6形成功能性復合體[16-17]，識別革蘭氏陽性菌肽聚糖(PGN)及脂磷壁酸(LTA)、革蘭氏陰性菌脂蛋白脂肽、牙齦卟啉單胞菌非典型脂多糖等。糞腸球菌是難治性根尖周病根管內(nèi)主要細菌，能使人成牙本質(zhì)細胞中TLR2/TLR1復合體的活化[18]。在以T淋巴細胞為主導的慢性根尖肉芽腫中，在CD4+CD3+CD14-T細胞上有TLR2表達[19]。TLR4是最先被發(fā)現(xiàn)于哺乳動物的TLRs，其主要配體是革蘭氏陰性菌的LPS[20]。TLR4能與髓樣細胞分化蛋白2(myeloid differentiation protein 2, MD2)，形成復合物發(fā)揮作用，參與LPS信號的識別和轉(zhuǎn)導，這在MCs上有所表現(xiàn)[21]。Vosskuhl 等[22]研究表明，經(jīng)TLR4激活的MCs，能夠使自然殺傷細胞的干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)分泌量增長20倍，增強MCs在固有免疫調(diào)控中的作用。

Figure 8.The density of TLR4-tryptase positive MCs. Mean±SD.n=20.**P<0.01vshealthy control;##P<0.01vsperiapical granuloma.

圖8各組標本組織中TLR4-tryptase雙陽性肥大細胞密度的比較

Figure 9.Density of TLR4-tryptase positive MCs and degranulated MCs. Mean±SD.n=20.**P<0.01vshealthy control;#P<0.05vsperiapical granuloma.

圖9各標本組織中TLR4-tryptase雙陽性MCs及脫顆粒MCs密度的比較

本實驗中我們發(fā)現(xiàn)TLR2-tryptase和TLR4-tryptase雙陽性MCs的數(shù)量在慢性根尖周病組織中較正常牙周膜組的數(shù)量顯著增多，而TLR2-tryptase和TLR4-tryptase雙陽性MCs在根尖囊腫組的數(shù)量明顯多于根尖肉芽腫組。本實驗結(jié)果是該領域的首次發(fā)現(xiàn)，提示TLR2-tryptase與TLR4-tryptase雙陽性MCs在根尖周病的發(fā)病中具有重要作用。因此，通過調(diào)控肥大細胞Toll樣受體可能成為阻止根尖周病發(fā)展的一個治療目標，從而為根尖周病的治療提供新的方向。

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)

Expression of TLR2 and TLR4 on mast cells in human chronic periapical diseases

TAO Zi-xi, FAN Wan-ting, LI Juan, HUANG Shi-guang

(FacultyofDentistry,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:thshg@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To observe the expression of TLR2 and TLR4 on mast cells (MCs) in the periapical tissues from different types of human chronic periapical diseases, and to analyze the role of TLR2 and TLR4 on tryptase-positive MCs in the immunopathogenesis of human chronic periapical diseases. METHODS: A total of 60 donors, including healthy control group, periapical granuloma group and periapical cyst group, were enrolled in the study. The periapical tissue specimens were fixed in 10% buffered formalin and stained with hematoxylin and eosin for histopathology, or stained with double-immunofluorescence for identification of TLR2-tryptase and TLR4-tryptase double-positive MCs in the periapical tissues. RESULTS: Compared with the healthy control, the densities of TLR2-tryptase and TLR4-tryptase double-positive MCs in periapical tissues were significantly increased in human chronic periapical diseases (P<0.01). The densities of TLR2-tryptase and TLR4-tryptase double-positive MCs in periapical cyst group were significantly higher than those in periapical granuloma group (P<0.01). CONCLUSION: TLR2 and TLR4 were expressed on the MCs in the periapical tissues of human chronic periapical diseases. TLR2-tryptase and TLR4-tryptase double-positive MCs may participate in the pathogenesis of chronic periapical diseases.

[KEY WORDS]Chronic periapical diseases; Mast cells; Toll-like receptor 2; Toll-like receptor 4

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.021

[中圖分類號]R781

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 020-85221165; E-mail: thshg@126.com

*[基金項目]廣東省社會發(fā)展領域科技計劃 (No. 2013B021800043； No. 2014A020212212)

[收稿日期]2015- 08- 31[修回日期] 2015- 09- 30

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0516- 06

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

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