董小變，　吳　娟,2，　莊曉東，　黃澤娜，　胡　洵，　廖新學(xué)△

(1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科,廣東 廣州 510080； 2江門市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科,廣東 江門529030)

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N-乙酰半胱氨酸對抗丙酮醛引起的心肌細胞損傷*

董小變1，吳娟1,2，莊曉東1，黃澤娜1，胡洵1，廖新學(xué)1△

(1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科,廣東 廣州 510080；2江門市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科,廣東 江門529030)

[摘要]目的： 觀察N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)對抗丙酮醛誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞損傷及相關(guān)機制。方法: 實驗分為正常對照組、丙酮醛損傷組(不同濃度丙酮醛處理)、NAC+丙酮醛組(NAC與丙酮醛共處理)、SP600125預(yù)處理+丙酮醛組、NAC組和SP600125組。H9c2心肌細胞常規(guī)消化種板，經(jīng)相應(yīng)處理24 h后：應(yīng)用CCK-8法檢測心肌細胞的存活率；Western blot法檢測H9c2心肌細胞內(nèi)磷酸化和總的c-Jun 氨基端激酶(p-JNK、t-JNK)表達水平；雙氯熒光素(DCFH-DA)染色法檢測心肌細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平；羅丹明123(Rh123) 染色法檢測細胞線粒體膜電位(MMP)；Hoechst 33258染色法觀察H9c2心肌細胞凋亡形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果: 與對照組相比，不同濃度的丙酮醛均能夠降低H9c2心肌細胞存活率，且呈劑量依賴性(P<0.01)， NAC在一定濃度范圍內(nèi)(500～1 500 μmol/L)可對抗丙酮醛引起心肌細胞損傷(P<0.01)，抑制丙酮醛引起細胞內(nèi)ROS水平升高，對抗丙酮醛引起細胞內(nèi)MMP降低，抑制丙酮醛誘導(dǎo)細胞內(nèi)JNK蛋白的磷酸化(P<0.01)。與NAC的細胞保護作用類似，選擇性JNK抑制劑SP600125也可抑制丙酮醛誘導(dǎo)的細胞損傷，包括減輕氧化應(yīng)激、改善線粒體膜電位及抑制細胞凋亡。結(jié)論: N-乙酰半胱氨酸能夠保護H9c2心肌細胞對抗丙酮醛引起的損傷，其機制可能與其降低細胞內(nèi)ROS水平、改善MMP、抑制JNK磷酸化和抗凋亡有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]H9c2細胞； N-乙酰半胱氨酸； 丙酮醛； c-Jun 氨基端激酶

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病患者的一種心臟并發(fā)癥，其發(fā)病機制復(fù)雜，涉及多種病理機制，如微血管病變、心肌纖維化、間質(zhì)炎癥、氧化應(yīng)激損傷、凋亡、自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及鈣內(nèi)穩(wěn)態(tài)異常等[1-2]。但引起上述心臟功能異?；驌p傷的信號通路尚未完全闡明。晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycosylation end-products, AGEs)是一類非酶催化的大分子糖基化產(chǎn)物，并隨著年齡而增加。大量研究已經(jīng)證實，AGEs及AGEs受體系統(tǒng)是參與糖尿病并發(fā)癥的重要原因[3]。而丙酮醛(methyl-glyoxal, MG)是AGEs的前體[4]，糖尿病患者體內(nèi)的MG水平與糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展直接相關(guān)[4-6]。因此，本實驗擬選用MG來建立心肌細胞糖尿病損傷模型，更能直接反映糖尿病心肌損傷的本質(zhì)。

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)是還原性谷胱甘肽的前體，是一種含有巰基的活性氧清除劑，在臨床上也是一種很好的祛痰劑，具有對抗各種原因所致的氧化損傷、調(diào)節(jié)基因的表達和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、抗細胞凋亡等作用[7-8]。

目前臨床上也無專門針對糖尿病心肌病的特效藥物，只能通過控制血糖、控制血壓及改善微循環(huán)等方法對癥治療，但總體治療效果欠佳。本研究旨在觀察N-乙酰半胱氨酸對抗丙酮醛誘導(dǎo)的心肌細胞損傷及相關(guān)機制，為臨床治療糖尿病心肌病提供新的實驗依據(jù)。

材料和方法

1材料及試劑

H9c2心肌細胞購自上海中科院細胞庫；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶均購自Gibco；CCK-8細胞計數(shù)試劑盒購自Dojindo；丙酮醛、N-乙酰半胱氨酸、Hoechst 33258、羅丹明123(rhodamine 123, Rh123)和雙氯熒光素(2′, 7′-dichlorofluorescein diacetate, DCFH-DA)購自Sigma；SP600125(JNK抑制劑)、總JNK抗體(t-JNK)和磷酸化JNK(p-JNK)抗體均購自CST；實驗用水為雙蒸水；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

2主要方法

2.1H9c2心肌細胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2心肌細胞，置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2～3 天進行細胞傳代，取對數(shù)生長期的心肌細胞進行下列實驗。

2.2MG對H9c2心肌細胞存活率的影響實驗分為正常對照組和不同濃度的MG處理組，取對數(shù)生長期的H9c2心肌細胞，0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液，以1×108/L的細胞密度接種于96孔板中，每孔100 μL。每組設(shè)5個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，用不同濃度的MG (0、100、200、400、600、800 μmol/L)處理H9c2心肌細胞24 h。然后吸出上清液，每孔加入含10% CCK-8的無血清培養(yǎng)基，37℃孵育3 h，用酶標(biāo)儀在測量波長450 nm處測量各孔的吸光度(A)，按照以下公式計算細胞存活率：細胞存活率(%) =處理組A值/對照組A值×100%。以上實驗重復(fù)3次。

2.3MG與NAC共處理對H9c2心肌細胞存活率影響實驗分為正常對照組、MG (400 μmol/L)處理組、MG+NAC (0、500、750、1 000、1 500 μmol/L)共處理組，取對數(shù)生長期的H9c2心肌細胞，0.25%胰蛋白酶消化后以1×108/L的細胞密度接種于96孔板中，每孔100 μL，每組設(shè)5個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，在400 μmol/L MG處理細胞的同時，加入不同濃度的NAC (0、500、750、1 000、1 500 μmol/L)處理H9c2細胞24 h，CCK-8法測定細胞存活率。以上實驗重復(fù)3次。

2.4Western blot法檢測p-JNK和t-JNK的表達實驗分為正常對照組、MG處理組、NAC (1 500 μmol/L) +MG組和NAC組，H9c2心肌細胞接種于35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，當(dāng)細胞生長到培養(yǎng)皿約80%面積時，進行上述實驗分組處理24 h。處理完成后，用預(yù)冷的PBS洗2次，加入細胞裂解液，4 ℃靜置30 min，然后刮下細胞，12 000 r/min離心10 min，取上清，采用BCA法進行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1～2 h，隨后加入p-JNK或t-JNK抗體(Ⅰ抗滴度均為1∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜；然后用TBST洗3次，每次10 min；再加入相應(yīng)的熒光Ⅱ抗(熒光Ⅱ抗滴度為1∶10 000)，室溫避光孵育1～2 h后，TBST漂洗3次，每次10 min。曝光時使用雙色紅外熒光成像系統(tǒng)，按照坐標(biāo)放好PVDF膜，蛋白面朝下，設(shè)置好軟件參數(shù)，掃描完成后直接獲得圖片。使用ImageJ 1.41o軟件進行灰度分析。

2.5H9c2心肌細胞內(nèi)的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平的檢測實驗分為正常對照組、MG處理組、MG+NAC共處理組、SP600125預(yù)處理+MG組、NAC處理組和SP600125處理組，其中MG、NAC處理濃度分別為400 μmol/L、1 500 μmol/L；SP600125(25 μmol/L)預(yù)處理30 min后PBS洗2次。以上組均按相應(yīng)處理因素培養(yǎng)24 h。將賴氨酸包被的蓋玻片置于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，H9c2心肌細胞均勻接種于蓋玻片上。當(dāng)細胞生長到培養(yǎng)孔約80%面積時，給予相應(yīng)處理24 h，每組均包括3個復(fù)孔。處理完成后，用PBS漂洗蓋玻片2次，用10 μmol/L DCFH-DA染液于37 ℃孵育30 min。在熒光顯微鏡下隨機選取5個不重復(fù)區(qū)域拍照，用ImageJ 1.41o軟件計算出5個視野綠色熒光強度的平均值，再對每組的樣本進行統(tǒng)計分析。

2.6H9c2心肌細胞內(nèi)線粒體膜電位(mitochondral membrane potential,MMP)的檢測實驗分組具體見2.5。將賴氨酸包被的蓋玻片置于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，H9c2心肌細胞均勻接種于蓋玻片上，給予相應(yīng)藥物處理24 h，蓋玻片用PBS洗2次，在含100 μg/L Rh123的無血清培養(yǎng)基中37℃孵育30 min，在熒光顯微鏡下隨機選取5個不重復(fù)區(qū)攝片，細胞核周圍綠色的亮點即為攝取了Rh123的線粒體。用ImageJ 1.41o軟件分析5個視野的綠色熒光強度平均值，再對每組的樣本進行統(tǒng)計分析。

2.7Hoechst33258染色法檢測H9c2心肌細胞凋亡實驗分組具體見2.5。H9c2心肌細胞經(jīng)不同因素處理后，小心棄去培養(yǎng)基, PBS洗1遍，4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗后，加入5 μg/L Hoechst 33258試劑,室溫避光染色10 min；再用PBS洗2次，每次5 min；然后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。Hoechst 33258不能被正常細胞所攝取，僅被凋亡細胞攝取。染色后，正常細胞核出現(xiàn)彌散均勻的低密度熒光；典型凋亡細胞核可見染色質(zhì)高度凝聚、固縮、邊緣化，進而細胞核裂解為碎塊，呈現(xiàn)顆粒狀熒光，有些會產(chǎn)生凋亡小體。

3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，統(tǒng)計資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗，兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1MG呈劑量依賴性降低H9c2心肌細胞存活率

如圖1所示，與對照組相比，不同濃度的丙酮醛均能夠降低H9c2心肌細胞存活率，且呈劑量依賴性(P<0.01)。其中400 μmol/L MG作用24 h后，H9c2心肌細胞存活率為(50.04±2.06)%，本研究選擇此濃度作為后續(xù)實驗的損傷濃度。

Figure 1.Effects of MG at different concentrations on viability of H9c2 cells. H9c2 cells were treated with increasing concentrations (ranging from 0 to 800 μmol/L) of MG for 24 h. Cell viability was measured by CCK-8 assay. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1MG對H9c2心肌細胞存活率的影響

2NAC保護H9c2心肌細胞對抗MG引起的細胞存活率降低

如圖2所示，與對照組相比，NAC在一定濃度范圍內(nèi)(500～1 500 μmol/L)可對抗MG引起心肌細胞損傷(P<0.01)，其中1 500 μmol/L NAC對心肌細胞的保護作用比較顯著，可提高細胞存活率30%左右，在后續(xù)的實驗中選擇1 500 μmol/L作為NAC有效保護濃度。

Figure 2.Effects of NAC at different concentrations in combination with MG on viability in H9c2 cells. H9c2 cells were treated with increasing concentrations (ranging from 500 to 1 500 μmol/L) of NAC and 400 μmol/L MG for 24 h. Cell viability was measured by CCK-8 assay. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsMG group.

圖2MG與NAC共處理對H9c2心肌細胞存活率的影響

3MG誘導(dǎo)H9c2心肌細胞內(nèi)JNK的磷酸化

H9c2 細胞分別經(jīng)0、200、400及600 μmol/L MG處理24 h 后，細胞內(nèi)總的JNK蛋白表達水平無明顯改變，而磷酸化JNK蛋白表達水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.Effects of MG at different concentrations on JNK phosphorylation. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖3不同濃度的MG對磷酸化JNK蛋白表達的影響

4NAC抑制MG誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞內(nèi)JNK蛋白的磷酸化

圖4顯示，靜息狀態(tài)的H9c2心肌細胞有少量的p-JNK表達，經(jīng)400 μmol/L MG損傷后p-JNK的表達明顯增加(P<0.01)，而加入1 500 μmol/L NAC共處理后可抑制MG誘導(dǎo)的p-JNK的表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。NAC本身對心肌細胞p-JNK表達無明顯影響。

5抑制JNK活化介導(dǎo)NAC保護H9c2細胞對抗MG引起的ROS水平升高

如圖5所示，細胞內(nèi)的ROS水平通過DCFH-DA染色進行檢測，DCF的熒光強度與ROS的水平呈正比，即綠色熒光越強，提示ROS的生成越多。正常H9c2細胞內(nèi)僅有少量ROS生成；與對照組相比，經(jīng)400 μmol/L MG損傷24 h后，心肌細胞內(nèi)ROS生成水平明顯升高(P<0.01)；但在MG作用同時用1 500 μmol/L NAC共處理，可明顯抑制MG誘導(dǎo)的ROS的生成增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)； 25 μmol/L的SP600125預(yù)處理亦可抑制MG誘導(dǎo)的ROS的生成增多；NAC和SP600125本身不影響心肌細胞內(nèi)ROS的生成。

Figure 4.Effects of NAC on MG-induced increase in phosphorylation of JNK in H9c2 cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsMG group.

圖4NAC對 MG誘導(dǎo)的磷酸化JNK表達上調(diào)的影響

6抑制JNK活化介導(dǎo)NAC對抗MG引起的MMP降低

如圖6顯示，線粒體膜受到損傷后膜電位就會降低。Rh123熒光染色法可檢測細胞內(nèi)MMP的改變。與對照組相比，H9c2心肌細胞經(jīng)400 μmol/L MG損傷24 h后，MMP 明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01) ，但同時給予1 500 μmol/L NAC，H9c2細胞的MMP降低較MG損傷組明顯改善(P<0.01)；用25 μmol/L SP600125預(yù)處理30 min，亦可改善400 μmol/L MG 引起的MMP降低；NAC和SP600125本身不影響心肌細胞的MMP。

7抑制JNK活化介導(dǎo)NAC的抗凋亡作用

采用Hoechst 33258核染色法檢測H9c2心肌細胞凋亡。正常的心肌細胞染色質(zhì)分布均勻，呈現(xiàn)彌散的低密度藍色熒光，MG處理組心肌細胞大部分呈現(xiàn)典型的凋亡特征，即細胞核固縮、出現(xiàn)顆粒狀熒光，1 500 μmol/L NAC可明顯地抑制MG誘導(dǎo)的致凋亡作用，使凋亡細胞數(shù)目減少；在MG處理前，用25 μmol/L SP600125預(yù)處理細胞30 min，亦可對抗MG引起的心肌細胞凋亡；NAC和SP600125本身對心肌細胞凋亡無明顯影響，見圖7。

Figure 5.Effects of NAC and MG treatment on ROS level of H9c2 cells (×100). ROS were measured by DCFH-DA staining followed by photofluorography． Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsMG group.

圖5MG與NAC對H9c2心肌細胞內(nèi)ROS水平的影響

討論

實驗結(jié)果表明，丙酮醛能夠抑制H9c2心肌細胞的存活率并誘導(dǎo)心肌細胞氧化應(yīng)激，并且呈濃度依賴性，提示丙酮醛具有心肌細胞毒性作用，這與國內(nèi)外研究結(jié)論一致[9-11]。丙酮醛的細胞毒性可能與其誘導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，表現(xiàn)為丙酮醛能使H9c2心肌細胞內(nèi)ROS生成增多, MMP降低，提示丙酮醛一方面可增加細胞內(nèi)氧自由基的生成，另一方面使心肌細胞內(nèi)抗氧化能力減弱，從而損傷心肌細胞的線粒體功能。課題組前期研究證實，與丙酮醛相類似，二氯化鈷通過促進細胞內(nèi)ROS生成、降低MMP引起H9c2心肌細胞損傷[12]，與本實驗結(jié)果相一致。

NAC可以對抗丙酮醛對心肌細胞的毒性作用，明顯地抑制丙酮醛對細胞內(nèi)ROS生成的促進作用，改善細胞MMP。上述結(jié)果表明，NAC的抗丙酮醛心肌細胞毒性作用可能與其抑制心肌細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。NAC是一種療效較好的祛痰劑，有研究表明NAC還具有較強的抗氧化功能，可清除已生成的自由基、抗細胞凋亡等作用[7, 13-14]，本研究結(jié)果證實，NAC可通過抑制心肌細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮抗丙酮醛對心肌細胞的毒性作用。

Figure 6.Effects of NAC and MG treatment on MMP level of H9c2 cells (×100). MMP of H9c2 cells was detected using the fluorescent dye Rh123. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsMG group.

圖6MG與NAC對H9c2心肌細胞內(nèi)線粒體膜電位(MMP)的影響

此外，JNK屬于絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族中的一個重要成員，JNK信號通路是糖尿病發(fā)病機制的重要通路[15]。本實驗結(jié)果表明，丙酮醛能夠促進心肌細胞c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)的活化，NAC則通過抑制JNK磷酸化對抗MG引起的心肌細胞損傷。與NAC類似，加入JNK抑制劑后可起到抗氧化應(yīng)激、改善線粒體膜電位、抗凋亡的作用。以往多項研究表明，糖尿病狀態(tài)下，氧化應(yīng)激能導(dǎo)致JNK激活[16-17]，這與本實驗結(jié)果一致。因此我們推測丙酮醛損傷心肌細胞的機制可能與氧化應(yīng)激進而活化JNK有關(guān)，而NAC可能通過清除細胞內(nèi)活性氧抑制JNK磷酸化。

綜上所述，丙酮醛對H9c2心肌細胞有損傷作用，這可能與其引起細胞內(nèi)氧化應(yīng)激及促進JNK磷酸化有關(guān)。NAC能對抗丙酮醛誘導(dǎo)的心肌細胞損傷作用，其機制可能與其抑制JNK磷酸化、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡有關(guān)。本實驗將為NAC的進一步應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

Figure 7.Effects of NAC on apoptosis (×100) .Morphological changes in cellular apoptosis in H9c2 cells were assessed by Hoechst 33258 staining．

圖7NAC的抗凋亡作用

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

N-acetylcysteine protects H9c2 cells against injuries induced by methyl-glyoxal

DONG Xiao-bian1, WU Juan1, 2, ZHUANG Xiao-dong1, HUANG Ze-na1, HU Xun1, LIAO Xin-xue1

(1DepartmentofCardiovasology,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;2DepartmentofCardiovasology,JiangmenCentralHospital,Jiangmen529030,China.E-mail:liaoxinx@mail.sysu.edu.cn)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the protective effect of N-acetylcysteine (NAC) on H9c2 cells from injuries induced by methylglyoxal (MG) and the potential mechanism. METHODS: H9c2 cells were divided into control group, MG treatment group, NAC + MG treatment group, SP600125 pretreatment + MG group, NAC group and SP600125 group. The viability of the H9c2 cells was measured by CCK-8 assay. The protein levels of p-JNK and t-JNK were tested by Western blot. The changes of intracellular reactive oxygen species (ROS) were evaluated by 2′, 7′- dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) staining. Mitochondrial membrane potential (MMP) was measured by rhodamine 123 (Rh123) staining. The morphological changes in apoptotic cardiomyocytes were detected by Hoechst 33258 staining. RESULTS: Du-ring 100～800 μmol/L concentration range, MG caused significantly reduced viability of the H9c2 cells in a dose-dependent manner. NAC had a protective effect on H9c2 cells against the injuries induced by MG during 500～1 500 μmol/L concentration range through raising cell viability, inhibiting cellular oxidative stress and improving MMP (P<0.01). SP600125,an inhibitor of JNK, showed the protective effect similar to NAC on H9c2 cells against MG-induced injuries, including attenuating oxidative stress, improving MMP and suppressing apoptosis.CONCLUSION: N-acetylcysteine offers obvious protective effect on H9c2 cells against the injuries induced by methylglyoxal. The underlying mechanisms may be associated with decreasing the production of ROS, ameliorating MMP, inhibiting the activation of JNK and suppressing apoptosis.

[KEY WORDS]H9c2 cells; N-acetylcysteine; Methylglyoxal; c-Jun N-terminal kinase

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.003

[中圖分類號]R363

[文獻標(biāo)志碼]A

通訊作者△Tel: 020-87332200； E-mail: liaoxinx@mail.sysu.edu.cn

*[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81270296)；廣東省財廳社會發(fā)展項目(No.2014SC107)

[收稿日期]2015- 10- 19[修回日期] 2015- 12- 21

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0398- 07

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