姜穎越　杜壽文　曹婷婷　趙　飛　王茂鵬　譚　鵬　辛　舒　朱羿龍　李文杰　李艷茹　李太元　李　昌④　金寧一④

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,延吉133002)

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穩(wěn)定表達人IFITM3的A549細胞株建立及其對禽流感病毒感染的抑制作用①

姜穎越杜壽文②③曹婷婷③趙飛③王茂鵬③譚鵬③辛舒③朱羿龍③李文杰③李艷茹李太元李昌③④金寧一③④

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,延吉133002)

[摘要]目的：為深入研究IFITM3抗禽流感病毒作用及其分子機制提供細胞模型，建立穩(wěn)定表達人IFITM3蛋白的A549細胞株。方法：首先合成引物，分離人外周血單個核細胞，PCR擴增IFITM3基因，進行DNA測序分析。測序正確后，將其克隆至慢病毒表達載體pLV-Puro中構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pLV-IFITM3，轉(zhuǎn)染A549細胞，在確定IFITM3可表達后，利用嘌呤霉素加壓篩選穩(wěn)定表達IFITM3的細胞株，通過熒光定量PCR和Western blot方法對獲得的穩(wěn)定細胞株進行鑒定，同時分析IFITM3蛋白在穩(wěn)定細胞株的分布及其對細胞活性的影響。最后，基于建立的穩(wěn)定細胞株，用H5N1亞型禽流感病毒作為病毒測試模型，對IFITM3的抗病毒活性進行了初步評價。結(jié)果：成功獲得人外周血單個核細胞源IFITM3基因，構(gòu)建了重組慢病毒表達質(zhì)粒，并通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)合嘌呤霉素壓力篩選獲得穩(wěn)定表達IFITM3的A549細胞，且IFITM3主要分布在膜組分上，并對細胞活性無顯著影響，同時IFITM3可抑制H5N1亞型禽流感病毒感染。結(jié)論：成功獲得穩(wěn)定表達IFITM3的A549細胞，證明了IFITM3可抑制H5N1亞型禽流感病毒感染，為進一步深入探討IFITM3限制流感病毒感染的作用機制和分子機理提供了細胞模型和實驗基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3;穩(wěn)定表達;禽流感病毒;抑制作用

干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白(Interferon-inducible transmembrane proteins,IFITMs)是近年發(fā)現(xiàn)的一類限制病毒進入的宿主限制因子，主要包括IFITM1、IFITM2和IFITM3[1]。另外，該類蛋白還包括IFITM5和IFITM10，但二者不具有抗病毒活性。自2009年Brass等報道IFITMs抑制甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)、西尼羅病毒(West Nile virus,WNV)和登革熱病毒(Dengue virus,DENV)復(fù)制的早期階段以來[2]，很多科研人員圍繞著該類蛋白的抗病毒譜、抗病毒機制和分子機制等進行了大量的探索。該類蛋白分子在其他多種囊膜病毒感染過程中發(fā)揮抗病毒活性，包括嚴重影響公共衛(wèi)生安全的病毒如埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)、馬爾堡病毒(Marburg virus,MARV)、水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)、SARS冠狀病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)、MERS冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)、裂谷熱病毒(Rift valley fever virus,RVFV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)、人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV-1)及呼吸道合胞體病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)等[3-11]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，IFITM3還可以抑制一種非囊膜病毒即呼腸孤病毒感染[12]。該類蛋白具有如此廣泛的抗病毒活性，其具體作用機制就此成為關(guān)注的焦點。

以甲型流感病毒為靶標的大量研究證實，IFITM蛋白作用于病毒進入階段，具體可能通過抑制病毒-細胞膜或內(nèi)體膜融合而抑制病毒進入[13,14]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，IFITM3對多種亞型的甲型流感病毒如H1N1、H3N2、H7N9及H5N1為外膜的假型病毒的進入具有抑制作用[4,15,16]，而且發(fā)現(xiàn)多種物種如禽、豬和蝙蝠來源的IFITM3均能限制流感病毒進入宿主細胞[17,18]。這些研究進展的取得多數(shù)得益于穩(wěn)定表達該類蛋白的細胞株，因為一些細胞如A549和MDCK轉(zhuǎn)染效率較低，蛋白表達量低，而且瞬時轉(zhuǎn)染對細胞的影響較大，無疑會影響試驗的穩(wěn)定性和重復(fù)性，給數(shù)據(jù)分析帶來不便。為此，本研究通過慢病毒表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)合嘌呤霉素篩選構(gòu)建穩(wěn)定表達IFITM3的A549細胞，進而分析其蛋白表達和對細胞活性的影響，并以H5N1亞型禽流感病毒為病毒模型初步探索IFITM3的抗病毒活性，為深入研究IFITM3的抗病毒機制提供細胞模型。

1材料與方法

1.1主要試劑人肺癌細胞A549由本實驗室保存；真核表達載體質(zhì)粒pLV-puro(北京英茂盛業(yè)公司)；Ex Taq DNA聚合酶、EcoRⅠ和BamHⅠ內(nèi)切酶及pMD18-T克隆載體(TaKaRa)；T4 DNA連接酶(NEB)；M- MLV反轉(zhuǎn)錄酶和GoTaq qPCR Master Mix(Promega)；UNIQ-10柱式總RNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)有限公司)；嘌呤霉素和Anti-Flag antibody(Sigma)；F12培養(yǎng)基(Hyclone)；X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent(Roche)；ECL免疫印跡化學(xué)發(fā)光溶液(Thermo)；Anti-IFITM3 antibody(Proteintech)；Anti-GAPDH antibody(碧云天公司)；HRP標記的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計與合成根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中人IFITM3(GenBank：JQ610621.1)基因序列，設(shè)計IFITM3基因擴增引物，上游(Fp3)添加EcoRⅠ酶切位點(加粗)、kozak序列(斜體)及Flag標簽序列(下劃線)，下游(Rp3)添加BamHⅠ酶切位點(加粗)。Fp3:5′-GAATTCGCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGAATCACACTGTCCAAAC-3′；Rp3:5′-GGATCCCTATCCATAGGCCTGGAAGA-3′。同時設(shè)計IFITM3定量PCR引物(qFp3:5′-ATGTCGTCTGGTCCCTGTTC-3′;qRp3:5′-GTCATGAGGATGCCCAGAAT-3′)，及GAPDH定量引物(qFp:5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′;qRp:5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3′)。引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2人外周血單核細胞分離及靶基因擴增取健康人外周血，與等量的Hanks液混合，利用Ficoll-Paque密度梯度離心收獲單核細胞PBMCs。Trizol法提取RNA，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以此cDNA為模板擴增IFITM3基因，并將其連接到pMD18T simple載體上記為pMD-IFITM3，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)，在篩選壓力下挑取陽性菌落并提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切鑒定，并送吉林庫美生物公司測序。

1.2.3重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建將測序正確的pMD-IFITM3用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，進行瓊脂糖凝膠電泳分離，DNA凝膠回收試劑盒回收IFITM3目的片段，將回收的片段克隆到真核表達載體pLV-puro上記為pLV-IFITM3，經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑取單克隆菌落、提取質(zhì)粒及酶切鑒定獲得重組表達質(zhì)粒，大量制備與純化，測定質(zhì)粒濃度及純度，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4A549細胞對嘌呤霉素敏感性分析在用嘌呤霉素篩選細胞之前，首先分析細胞對嘌呤霉素的敏感性。即分別用終濃度為0.5、1、2、3、4、5、6 μg/ml嘌呤霉素處理A549細胞，處理后每天在顯微鏡下觀察并記錄不同濃度的嘌呤霉素處理下的細胞狀態(tài)，確定最佳的嘌呤霉素篩選濃度。

1.2.5轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定細胞株的篩選將生長狀態(tài)良好的A549細胞(3×105cells)接種至6孔細胞板中，次日待細胞長至單層細胞時，利用X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑(轉(zhuǎn)染試劑∶質(zhì)粒為 2∶1)轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染后6 h更換新鮮的完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2溫箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h時，收集部分細胞提取細胞蛋白，另一部分細胞中加入嘌呤霉素至終濃度為4 μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)直至在嘌呤霉素壓力下，無新的死亡細胞出現(xiàn)。收集穩(wěn)定細胞株，分別提取細胞蛋白和RNA，利用Western blot和定量PCR分析穩(wěn)定細胞株中IFITM3蛋白的表達情況。

1.2.6穩(wěn)定細胞株的細胞活性分析用MTS法分析獲得的穩(wěn)定細胞株A549-IFITM3和A549-Vector的細胞活性。將細胞(2×103cells/well)接種至96孔細胞板中，同時設(shè)A549正常細胞對照，且每種細胞設(shè)6個重復(fù)，置于37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)，分別在12、24、36和48 h進行細胞活性檢測。

1.2.7細胞膜蛋白與漿蛋白的分離收集穩(wěn)定細胞株，參考“細胞膜蛋白與漿蛋白抽提試劑盒(碧云天)”操作說明分離細胞的膜蛋白和漿蛋白。細胞中加入膜蛋白抽提試劑A，置于液氮和室溫反復(fù)凍融3次裂解細胞，4℃低速離心收集上清，然后4℃，14 000 r/min離心40 min分別收集沉淀和上清，沉淀加入膜蛋白抽提試劑B提取膜蛋白，測定蛋白濃度，Western blot分析IFITM3蛋白在膜蛋白和漿蛋白中的分布。

1.2.8病毒感染分析將穩(wěn)定細胞株A549-IFITM3及其對照細胞(1×105cells/well)接種于12孔板中，置于溫箱培養(yǎng)，次日按1 MOI接種H5N1亞型禽流感病毒于細胞中，4℃吸附1 h，然后用冷PBS洗2次，迅速轉(zhuǎn)移至37℃溫箱，分別在吸附后0、2、6、12、24、36、48 h收集細胞，提取細胞總RNA，用RT-qPCR方法分析細胞中病毒基因的相對量。

2結(jié)果

2.1IFITM3基因克隆及序列分析分離健康人外周血單核細胞PBMCs，提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板，擴增人IFITM3基因。如圖1A所示，PCR擴增獲得約420 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。目的片段DNA測序結(jié)果顯示，人PBMCs源IFITM3基因與GenBank登錄的序列完全一致。同時還將PBMCs源的IFITM3與其他細胞來源的基因進行氨基酸比對，發(fā)現(xiàn)PBMCs源的IFITM3氨基酸序列與293T細胞源的完全一致，但與HeLa源的IFITM3存在1個氨基酸差異(71 aa，圖1B)。

2.2重組表達質(zhì)粒pLV-IFITM3的鑒定用EcoRⅠ和BamHⅠ將IFITM3基因片段從測序正確的pMD-IFITM3酶切回收，連接到pLV-Puro慢病毒表達載體上，轉(zhuǎn)化后挑單克隆菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定。結(jié)果顯示，EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切pLV-IFITM3質(zhì)粒獲得約420 bp的條帶(圖1C)，表明表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3A549對嘌呤霉素的敏感性分析為了確定穩(wěn)定細胞株篩選過程中嘌呤霉素的最佳濃度，用不同濃度的嘌呤霉素處理A549，觀察并記錄細胞狀態(tài)。實驗發(fā)現(xiàn)，終濃度為2 μg/ml嘌呤霉素處理后第1天細胞中有漂浮細胞出現(xiàn)，且隨嘌呤霉素濃度的增大，死亡細胞數(shù)增多；第2天，4 μg/ml嘌呤霉素處理的A549細胞絕大部分漂浮。因此選擇穩(wěn)定細胞株篩選時嘌呤霉素的終濃度為4 μg/ml。

2.4穩(wěn)定表達IFITM3細胞株的篩選與鑒定pLV-IFITM3轉(zhuǎn)染A549細胞48 h時，胰酶消化，收集部分細胞，提取細胞總蛋白，用Flag抗體檢測IFITM3的表達。結(jié)果如圖2A所示，F(xiàn)lag抗體和IFITM3抗體均檢測到pLV-IFITM3轉(zhuǎn)染細胞中IFITM3的表達，而在空載體轉(zhuǎn)染細胞中存在IFITM3固有表達。其余細胞繼續(xù)傳代并加嘌呤霉素(終濃度為4 μg/ml)進行篩選，直至沒有死亡細胞出現(xiàn)，收獲篩選獲得的細胞株，提取細胞總RNA和蛋白，利用RT-PCR和Western blot對獲得的穩(wěn)定細胞株進行鑒定。結(jié)果如圖2B～D所示，相對于載體對照細胞，穩(wěn)定表達IFITM3的A549細胞中IFITM3基因呈高水平轉(zhuǎn)錄(約300 000倍)；而且用IFITM3抗體和Flag抗體均檢測到IFITM3在穩(wěn)定細胞株中的表達。

圖1　IFITM3基因的擴增、序列分析和重組質(zhì)粒鑒定Fig.1　Amplification(A),sequence analysis(B)of IFITM3 and identification of its recombinant plasmid pLV-IFITM3(C)

2.5IFITM3在細胞中的定位分離篩選獲得的穩(wěn)定細胞株的膜蛋白和漿蛋白，并通過Western blot方法分析IFITM3蛋白表達定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在A549-IFITM3細胞的膜蛋白中檢測到IFITM3的表達，在

其漿蛋白和載體對照細胞的膜蛋白及漿蛋白中均未檢測到該蛋白的表達(圖3)，表明IFITM3表達定位在細胞膜組分上，與其他相關(guān)報道一致[19]。

2.6IFITM3對細胞活性的影響分析利用MTS法分析穩(wěn)定表達IFITM3的A549細胞及其載體對照細胞的細胞活性。結(jié)果如圖4所示，A549-IFITM3的細胞活性在傳代后12 h稍低于載體對照細胞，但培養(yǎng)24～48 h兩者的細胞活性沒有顯著差異。整體上，IFITM3表達沒有顯著影響A549的細胞活性。

圖2　穩(wěn)定表達IFITM的A549細胞株的鑒定Fig.2　Indentification of A549-IFITM3 cells

圖3　穩(wěn)定細胞株中IFITM3表達分布Fig.3　Expression distribution of IFITM3 in A549-IFITM3 cells

2.7IFITM3對H5N1亞型禽流感病毒的抑制作用基于篩選獲得的穩(wěn)定表達IFITM3的A549細胞株，利用熒光定量PCR方法檢測H5N1亞型禽流感病毒結(jié)構(gòu)蛋白M1(圖5A)和M2(圖5B)基因的變化，初步分析IFITM3對H5N1亞型禽流感病毒感染的影響。結(jié)果顯示，相對于載體對照細胞而言，IFITM3過表達細胞感染后兩個病毒基因的表達呈現(xiàn)明顯延后的趨勢，且在吸附后0 h時病毒基因的量較少，表明IFITM3能夠顯著抑制H5N1亞型禽流感病毒的感染，而且這種抑制作用可能發(fā)生在病毒的進入過程，上述研究與前人報道一致[4]，表明本研究已成功建立穩(wěn)定表達IFITM3的A549細胞株，該細胞株可用于進一步分析IFITM3限制病毒感染的機制研究。

圖4　穩(wěn)定細胞株的細胞活性分析Fig.4　Cell viability analysis of A549-IFITM3

圖5　IFITM3抑制H5N1禽流感病毒感染Fig.5　IFITM3 protein restricts H5N1 avian influenza virus infection in A549 cellsNote: *.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

3討論

Ⅰ型干擾素(Interferon)是機體發(fā)揮抗病毒天然免疫的主要細胞因子，其與細胞表面受體結(jié)合，激活JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)大量的干擾素刺激基因(Interferon-stimulated genes,ISGs)表達，從而發(fā)揮抗病毒、抗腫瘤或免疫調(diào)節(jié)作用[20,21]。作為其中重要的一員，IFITM蛋白廣泛表達在多種組織和細胞，是一種宿主細胞內(nèi)源性限制因子，在宿主內(nèi)源性抗病毒免疫中發(fā)揮重要作用。早在1996年就有IFITMs蛋白抗VSV和HCV感染的研究線索[22]，但沒有引起科學(xué)家的特別關(guān)注，直至2009年報道證實IFITM蛋白抑制甲型流感病毒的進入階段[2]，自此掀開了研究其抗病毒譜及其作用機制的熱潮，特別是IFITM3。目前已知IFITM3對很多囊膜病毒和一些非囊膜病毒具有抑制作用，涉及10個病毒科20多種病毒，其中不乏嚴重威脅人類生命健康的烈性病毒如EBOV、H7N9及SARS-CoV等[23]。

研究表明，IFITM3蛋白主要定位在內(nèi)體或溶酶體膜上，但在細胞質(zhì)膜表面也有表達，且主要以Ⅱ型跨膜結(jié)構(gòu)蛋白存在[19]。另外，IFITM3蛋白上一些位點的棕櫚?；?、泛素化及磷酸化調(diào)節(jié)該蛋白的表達、定位也與抗病毒活性有關(guān)[24,25]。近期，針對IFITM3抑制病毒進入的作用機制，很多學(xué)者提出了多種設(shè)想。其一，IFITM3蛋白可能改變內(nèi)體溶酶體腔的特性，不利于病毒融合，這可以解釋該蛋白似乎在細胞質(zhì)膜上不抑制病毒進入[23]；其二，IFITM3改變膜的特性來抑制融合微孔的形成和擴張[23]，如內(nèi)體或溶酶體膜上膽固醇堆積[26]、膜曲率改變等。然而，另有報道質(zhì)疑IFITM3抑制病毒進入與內(nèi)體膽固醇堆積的相關(guān)性。盡管在IFITM作用機制方面取得了很多進展，但具體的作用機制尚需進一步深入研究。

本研究從人外周血單個核細胞中擴增IFITM3基因并構(gòu)建重組慢病毒表達質(zhì)粒。為了避免假型病毒感染對宿主細胞的影響，實驗通過重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)合嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達IFITM3的A549細胞，且穩(wěn)定細胞株中IFITM3在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均獲得高效表達，并主要表達在細胞膜結(jié)構(gòu)上。同時，穩(wěn)定表達IFITM3的A549細胞與載體對照細胞對細胞的活性沒有顯著差異，為下一步病毒感染評價奠定了基礎(chǔ)。進而，以嚴重影響公共衛(wèi)生安全的H5N1亞型禽流感病毒為測試模型對所構(gòu)建的穩(wěn)定細胞株中IFITM3的抗病毒活性進行評價，結(jié)果表明該細胞能夠抑制病毒感染，從而為IFITM3抗病毒機制的深入探索及抗病毒藥物的研發(fā)提供了細胞模型和前提基礎(chǔ)。

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[收稿2015-11-19]

(編輯張曉舟)

Establishment of A549 cell stain stably expressing human IFITM3 and its inhibition to avian influenza virus infection

JIANGYing-Yue,DUShou-Wen,CAOTing-Ting,ZHAOFei,WANGMao-Peng,TANPeng,XINShu,ZHUYi-Long,LIWen-Jie,LIYan-Ru,LITai-Yuan,LIChang,JINNing-Yi.

CollegeofAgriculture,YanbianUniversity,Yanji133002,China

[Abstract]Objective:To establish human lung carcinoma A549 cell stain stably expressing human interferon-inducible transmembrane protein 3(IFITM3)and provide a cell model for the research of the antiviral effect of IFITM3 and its molecular mechanism.Methods: Full-length IFITM3 gene was amplified from the cDNA of human peripheral blood mononuclear cells isolated previously,and cloned into a lentivirus expression vector pLV-Puro resulting into pLV-IFITM3 after DNA sequencing.IFITM3 was transfected into A549 cells to screen the cell stain stably expressing IFITM3(A549-IFITM3)with puromycin.The expression and distribution of IFITM3 and cell viability were detected and by quantitative PCR,Western blot and MTS assay respectively.Then the inhibitory effect of IFITM3 protein was preliminarily evaluated with H5N1 avian influenza virus as the virus model.Results: The A549 cell stain stably expressing IFITM3 was obtained by plasmid transfection and puromycin screening,and IFITM3 mainly distributed in the membrane fraction in the cell strain and had no significant effect on cell viability,and displayed strong restriction effect on H5N1 infection.Conclusion: A549 cells stably expressing IFITM3 were established and IFITM3 restricted avian influenza virus infection,providing the cell model and experimental basis to further explore its antiviral role and the molecular mechanism.

[Key words]Interferon-inducible transmembrane protein 3;Stable expression;Avian influenza virus;Restriction

中圖分類號S855.3

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0372-06

通訊作者及指導(dǎo)教師：李昌(1978年-)，男，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事分子病毒學(xué)與免疫學(xué)方面的研究，E-mail：lichang78@163.com。

作者簡介：姜穎越(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事病毒感染與免疫學(xué)研究，E-mail：jessicajiang4521@163.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.017

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

①本文為國家自然科學(xué)基金資助項目(31472197)、吉林省青年科研基金項目(20140520173JH)和病原微生物生物安全國家重點實驗室開放課題(SKLPBS1435)資助。

②共同第一作者。

③吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點實驗室, 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所, 長春130122。

④江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州225009。

金寧一(1956年-)，男，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事分子病毒學(xué)與免疫學(xué)方面的研究，E-mail：ningyik@126.com。