史振偉　許　焱　李曉璐　劉慶陽

(煤炭總醫(yī)院腎內(nèi)科，北京100028)

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銀耳多糖改善膿毒癥小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫活性①

史振偉許焱李曉璐劉慶陽②

(煤炭總醫(yī)院腎內(nèi)科，北京100028)

[摘要]目的：探討銀耳多糖(TPS)對膿毒癥小鼠外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的作用。方法：雄性BALB/c小鼠(20±1)g，采用燒傷后腹腔注射銅綠假單胞菌制作膿毒癥并予以TPS干預(yù)，隨機(jī)分成5組，分別為正常對照組(未做任何處理)，未刺激組(燒傷后銅綠假單胞菌感染未經(jīng)TPS處理組)，TPS低劑量組(燒傷后銅綠假單胞菌感染+50 mg/kg治療組)，TPS中劑量組(燒傷后銅綠假單胞菌感染+100 mg/kg治療組)，TPS高劑量組(燒傷后銅綠假單胞菌感染+200 mg/kg治療組)，從各組的外周血中分離調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，并體外培養(yǎng)。自燒傷即刻(PBD0)起，至燒傷后4 d每天監(jiān)測培養(yǎng)上清液中IL-10、IFN-γ、IL-4的水平。磁珠孵育和磁性分離小鼠外周血的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25highTregs)和CD4+T細(xì)胞，分別加入TPS后進(jìn)行培養(yǎng)，以不加TPS的細(xì)胞作為對照，流式細(xì)胞儀分析CD4+CD25highTregs的表型，ELISA法檢測細(xì)胞因子的表達(dá)。結(jié)果：與對照組相比，TPS能顯著降低未刺激組小鼠的IL-10和IL-4的分泌，并顯著增加IFN-γ的分泌，并且IL-10的分泌水平與TPS濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系。體外培養(yǎng)試驗中，與正常對照組相比，未刺激組的CD4+ T細(xì)胞增殖和IFN-γ水平顯著降低(P<0.05)，IL-4水平顯著升高(P<0.05)；與未刺激組相比，TPS刺激組的CD4+T 細(xì)胞增殖和IFN-γ水平顯著升高(P<0.05)，IL-4水平顯著降低(P<0.05)；與未刺激組相比，TPS刺激+抗體1組CD4+T 細(xì)胞增殖和IFN-γ水平顯著升高(P<0.05)，IL-4水平顯著降低(P<0.05)；與未刺激組相比，TPS刺激+抗體2組的CD4+T 細(xì)胞增殖和IFN-γ、IL-4水平無顯著性差異。結(jié)論：TPS可以通過降低IL-10的分泌抑制CD4+CD25highTregs對CD4+ T淋巴細(xì)胞增殖和極化的影響，并誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1分型，從而使機(jī)體免疫活性增強(qiáng)。

[關(guān)鍵詞]銀耳多糖；調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞；膿毒癥；燒傷；IL-10

研究證明，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在膿毒癥中起重要作用，其主要功能是在患者創(chuàng)傷后抑制T細(xì)胞的增殖，并抑制Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生。膿毒癥的免疫反應(yīng)是誘導(dǎo)促炎反應(yīng)和抗炎反應(yīng)達(dá)成一個復(fù)雜的平衡狀態(tài)，從而限制對宿主組織的損傷，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在這種平衡中起了至關(guān)重要的作用，如果調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的負(fù)向免疫調(diào)節(jié)占了主導(dǎo)地位，平衡將會消失,進(jìn)而出現(xiàn)無法治愈的免疫抑制。眾所周知，在膿毒癥后期會出現(xiàn)無法控制的免疫抑制狀態(tài)，這是多器官功能障礙綜合征甚至死亡的主要原因[1-3]。銀耳多糖(Tremella polysaccharides,TPS)具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化老化、降低血糖、抗凝血血栓形成、抗?jié)?、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、抗病毒、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長和改善記憶等生物活性，已被證實具有改善免疫抑制狀態(tài)的作用[4]。本研究觀察TPS對分泌IL-10的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群——CD4+CD25highTregs功能的影響，旨在為探討TPS干預(yù)燒傷后膿毒癥后期免疫抑制狀態(tài)的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑TPS(陜西慈緣生物技術(shù)有限公司)，抗IL-10抗體(美國eBioscience公司)，RPMI-1640、胎牛血清(FCS)、谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素和HEPES(北京天潤善達(dá)生物技術(shù)有限公司)，小鼠CD4+CD25highTregs微磁珠(德國MiLtenyi Biotec公司)，噻唑藍(lán)(MTT)和TritonX-100(Sigma公司)，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記抗小鼠CD4、藻紅蛋白，PE標(biāo)記抗小鼠CD25和純化大鼠抗小鼠CD3和CD28(BD/PharMingen公司)，IL-2 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、IL-4 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒和干擾素-γ酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(Biosource公司)，ATCC27853 銅綠假單胞菌 (ATCC 公司,美國)。

1.1.2動物雄性BALB/c小鼠，6～8周齡，體重(20±1)g(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京實驗動物中心)。自由進(jìn)水進(jìn)食，人工照明，保持 12 h 開/關(guān)。所有實驗動物的護(hù)理和使用均嚴(yán)格遵守國家研究所健康指南。

1.2方法

1.2.1燒傷后銅綠假單胞菌感染模型建立根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分三組：假燙對照組；燙傷+細(xì)菌組。在小鼠的背部用水浴(37℃)持續(xù)接觸 8 s，計算燙傷面積 10%總體表面積(TBSA)背部燙傷；此為假燙組。燙傷細(xì)菌組在小鼠的背部用開水(100℃)持續(xù)接觸8 s，計算燙傷面積 10%TBSA Ⅲ°；在燒傷后1 d(PBD1)，小鼠背部創(chuàng)面中心注射 50 μl的 ATCC27853 銅綠假單胞菌菌液(1×106CFU)，此為模型組。在PBD 1、2和3，小鼠腹腔注射TPS(50、100和200 mg/kg)。

1.2.2實驗設(shè)計105只小鼠被分為五組，各組分組情況如下:A.假燒傷組 BALB/c小鼠5只；B.燒傷+銅綠假單胞菌感染組 BALB/c小鼠25只；C.燒傷+銅綠假單胞菌感染+TPS(50 mg/kg)治療組 BALB/c小鼠25只；D.燒傷+銅綠假單胞菌感染+TPS(100 mg/kg)治療組 BALB/c小鼠25只；E.燒傷+銅綠假單胞菌感染+TPS(200 mg/kg)治療組 BALB/c小鼠25只。B、C、D、E組再分出4個亞組，每組有5只小鼠，小鼠們分別在燒傷后1、2、3、4 d被處死，另外有5只小鼠被作為正常對照組。在指點時間點處死所有的小鼠，立即收集外周血樣本用以獲得Tregs和T淋巴細(xì)胞。

1.2.3磁珠孵育和磁性分選外周血Treg和CD4+T淋巴細(xì)胞富集的小鼠外周血T淋巴細(xì)胞，不含抗體及磁珠，細(xì)胞計數(shù)，用于下游實驗。Treg淋巴細(xì)胞的純化通過Treg試劑盒選出；CD4+T淋巴細(xì)胞使用CD4+T淋巴細(xì)胞試劑盒分選得到，操作步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞在RPMI1640中培養(yǎng)并加入2 nmol/L的L-谷氨酰胺，5 mmol/L的HEPES和100 U/ml青霉素，100 mg/ml鏈霉素(BioWhittaker公司),0.5 mmol/L的丙酮酸鈉，0.05 mmol/L的非必需氨基酸和5%血清。50 ml 抗CD3抗體稀釋到PBS(Life Technologies公司)，以5或0.05 mg/ml的指定濃度加入到每個培養(yǎng)孔，放置在37℃下4 h，并然后用PBS洗滌兩次。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附分析細(xì)胞因子含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清-RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸CD4+CD25highT淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/ml，取0.2 ml接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，另加TPS處理(200 μg/ml，以不加TPS的細(xì)胞作為對照)。24 h后收集上清液，采用ELISA測定IFN-γ、 IL-4水平，嚴(yán)格按說明書步驟操作。

1.2.6混合淋巴細(xì)胞體外反應(yīng)檢測脾T淋巴細(xì)胞增殖功能及Th1/Th2功能性極化磁珠孵育和磁性分選小鼠燒傷后第二天(PBD2)、第三天(PBD3)及第四天(PBD4)外周血Treg和正常鼠CD4+T淋巴細(xì)胞，將CD4+T淋巴細(xì)胞分為正常對照組(未作任何處理)，未刺激組(加入未經(jīng)TPS處理的Treg淋巴細(xì)胞與CD4+T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng))，TPS刺激組(加入經(jīng)200 μg/ml TPS處理后的Terg淋巴細(xì)胞與CD4+T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng))，TPS刺激+抗體1組(加入經(jīng)200 μg/ml TPS處理后的Treg淋巴細(xì)胞、IL-10抗體與CD4+T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng))和TPS刺激+抗體2組(加入經(jīng)200 μg/ml TPS處理后的CD4+CD25highT淋巴細(xì)胞、IL-10的同型對照抗體與CD4+T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng))?；旌吓囵B(yǎng)24 h后采用含體積分?jǐn)?shù)10%FBS-RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸脾T淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個/ml，取0.2 ml接種于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，另加100 μl 刀豆素A(5 μg/ml)進(jìn)行刺激。常規(guī)培養(yǎng)18 h，加入不同細(xì)胞數(shù)的Treg淋巴細(xì)胞，使培養(yǎng)液中Treg淋巴細(xì)胞與脾T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞比例為1∶100，每組3個平行孔。孵育68 h，再向各孔加入10 μl噻唑藍(lán)(5 mg/ml)，輕微振蕩，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。加100 μl Triton-異丙醇溶液，37℃溫箱過夜，測定波長540 nm下吸光度值以檢測脾T淋巴細(xì)胞增殖功能；分別于刺激后3 d留取上清，應(yīng)用流式細(xì)胞磁珠分析術(shù)(Cytometric beads array system，CBA)檢測各組上清中IFN-γ、IL-4水平(分別反映Th1和Th2改變)，首先對含IL-4、IFN-γ等兩種CBA微球進(jìn)行抗體包被，并對所包被的IL-4、IFN-γ抗體進(jìn)行標(biāo)染，染色滿意后，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2結(jié)果

2.1TPS抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞IL-10的分泌從各組的外周血中分離調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，并在體外培養(yǎng)。自燒傷即刻(PBD0)起，至燒傷后4 d每天監(jiān)測培養(yǎng)上清液中IL-10的水平，并記錄下來(表1)。未刺激組中IL-10的水平異常增高，TPS顯著降低IL-10水平，并呈劑量依賴性(P<0.05)。

2.2TPS影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞IFN-γ、IL-4的分泌從各組的外周血中分離出調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，并在體外培養(yǎng)后，自燒傷即刻(PBD0)起，至燒傷后4 d每天監(jiān)測培養(yǎng)上清液中的IFN-γ、IL-4(圖1)。圖A中可以看出，與未刺激組比較，不同時間點TPS處理組IFN-γ的水平升高，而IL-4水平降低，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系(P<0.05)。不同劑量的TPS處理組與未刺激組相比，由CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4的水平顯著增加(P<0.05)，與此相反，IFN-γ的水平顯著降低(P<0.05)。

2.3在體外TPS對膿毒癥小鼠的CD4+T細(xì)胞的增殖和分化以及IFN-γ、IL-4分泌水平的影響

2.3.1TPS影響膿毒癥小鼠的CD4+T細(xì)胞的增殖和分化體外培養(yǎng)試驗中，與正常對照組相比，未刺激組的CD4+T細(xì)胞增殖和IFN-γ水平顯著降低(P<0.05)，IL-4水平顯著升高(P<0.05)；與未刺激組相比，TPS刺激組的CD4+T 細(xì)胞增殖和IFN-γ水平顯著升高(P<0.05)，IL-4水平顯著降低(P<0.05)；與未刺激組相比，TPS刺激+抗體1組CD4+T 細(xì)胞增殖和IFN-γ水平顯著升高(P<0.05)，IL-4水平顯著降低(P<0.05)；與未刺激組相比，高濃度TPS刺激+抗體2組的CD4+T 細(xì)胞增殖和IFN-γ、IL-4水平無顯著性差異。見表2。

IL-10BurnsepsisTPS(50mg/kg)TPS(100mg/kg)TPS(200mg/kg)PBD0150±12151±11149±15150±16PBD1321±14291±19275±13237±21PBD2353±18316±21281±18243±19PBD3501±28399±181)298±201)2)252±171)2)PBD4375±17228±19237±16185±22

Note：1)P<0.05，compared to burn sepsis；2)P<0.05 compared to TPS group(50 mg/kg).

圖1　TPS處理后調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ和IL-4的變化Fig.1　Effect of TPS on CD4+ T cells proliferation in septic miceNote: Compared to burn sepsis,*.P<0.05；compared to TPS group(50 mg/kg)，#.P<0.05.

TimeCD4+TCD4+T+TregCD4+T+Treg+TPS(200μg/ml)CD4+T+Treg+anti-IL-10CD4+T+Treg+IL-10IsotypePBD20.52±0.031)0.27±0.050.48±0.071)0.37±0.041)0.26±0.04PBD30.51±0.021)0.16±0.060.46±0.061)0.34±0.031)0.14±0.05PBD40.54±0.041)0.31±0.020.47±0.051)0.38±0.041)0.31±0.03

Note：1)P<0.05，compared to CD4+CD25highT cells+CD4+T cells.

TimeCD4+TCD4+T+TregCD4+T+Treg+TPS(200μg/ml)CD4+T+Treg+anti-IL-10CD4+T+Treg+IL-10IsotypePBD2209±281)108±21199±271)175±191)121±23PBD3211±311)89±17195±251)169±211)95±19PBD4198±271)105±19201±181)181±201)117±16

Note：1)P<0.05，compared to CD4+CD25highT cells +CD4+T cells.

CD4+TCD4++TregCD4++Treg+TPS(200μg/ml)CD4+T+Treg+anti-IL-10CD4+T+Treg+IL-10IsotypePBD2102±171)285±24121±191)187±161)277±22PBD3111±211)291±27132±221)193±191)283±25PBD4123±191)248±23148±281)178±301)237±32

Note：1)P<0.05，compared to CD4+CD25highT cells +CD4+T cells.

2.3.2在體外TPS對CD4+T細(xì)胞的IFN-γ、IL-4分泌影響通過表3、4看出，正常對照組、未刺激組、TPS刺激組、TPS刺激+抗體1組和TPT刺激+抗體2組IFN-γ、IL-4的水平，其中TPS刺激組和TPT刺激+抗體1組IFN-γ明顯高于未刺激組(P<0.05)，IL-4明顯低于未刺激組(P<0.05)，TPS刺激+抗體2組與未刺激組無顯著性差異。

3討論

在過去的20年里，盡管大量抗生素和其他支持治療不斷進(jìn)展，膿毒癥仍然是重癥監(jiān)護(hù)病房的首要死亡原因。并且這些病人均有免疫功能抑制[5]。膿毒癥中的免疫抑制，亦稱“免疫麻痹”，是以包括單核細(xì)胞失活，內(nèi)毒素耐受，中性粒細(xì)胞功能受損，淋巴細(xì)胞功能障礙和凋亡為特點[6]。最近的研究主要集中在實驗和臨床膿毒癥病人調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表型和功能上[7]。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例的持續(xù)性增加與較差的長期預(yù)后是有一定關(guān)聯(lián)的。因此推測調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的異常變化可能是膿毒癥的一個重要的致病因素。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制機(jī)制有待確定，這些細(xì)胞通過細(xì)胞間的直接接觸或間接通過抗炎介質(zhì)的分泌(如：IL-10)可以抑制免疫細(xì)胞功能[8]。IL-10是一種抗炎細(xì)胞因子可以抑制促炎細(xì)胞因子的生產(chǎn)。本實驗結(jié)果顯示：產(chǎn)生IL-10的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在燒傷膿毒癥小鼠體內(nèi)顯著增加，CD4+T細(xì)胞的增殖被顯著抑制，燒傷后綠膿桿菌感染后Th2細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-4異常增強(qiáng)，IFN-γ明顯下降，以上表明在膿毒癥晚期Th1和Th2之間的應(yīng)答平衡遭到破壞。因此，我們推測在膿毒癥晚期，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的異?；顒硬焕谀摱景Y的恢復(fù)。

體外實驗的結(jié)果證實自燒傷后膿毒癥小鼠體內(nèi)分離出來的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可顯著抑制CD4+T細(xì)胞的增殖，并且抗IL-10抗體可部分阻斷調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞的抑制效果，與體內(nèi)結(jié)果相一致。

有研究表明：中藥作為免疫調(diào)節(jié)劑可用于提高免疫力。銀耳多糖有免疫調(diào)節(jié)功能，可對抗化療藥物引起的免疫抑制[4]。目前還不清楚TPS能否通過改善調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的異常活動而改善膿毒癥。為此，我們應(yīng)用銀耳多糖治療遭受燒傷及綠膿桿菌感染的小鼠，觀察了TPS在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的調(diào)節(jié)免疫活動中的作用，TPS可以通過降低IL-10、IL-4，增加IFN-γ的分泌水平抑制CD4+CD25highTreg對CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖作用；體外實驗中，在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)之前，CD4+CD25highTreg細(xì)胞先用TPS(200 μg/ml)刺激，我們發(fā)現(xiàn)，TPS顯著逆轉(zhuǎn)的CD4+CD25highTreg介導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞的增殖和分化誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化，二者結(jié)果一致。因此，TPS可以抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞由Th2轉(zhuǎn)化為Th1，最終改善膿毒癥預(yù)后。

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[收稿2015-06-11修回2015-07-06]

(編輯張曉舟)

Tremella Polysaccharides attenuated sepsis through inhibiting abnormal CD4+CD25highregulatory T cells in mice

SHIZhen-Wei,XUYan,LIXiao-Lu,LIUQing-Yang.

DepartmentofNephrology,ChinaMeitanGeneralHospital,Beijing100028,China

[Abstract]Objective:To determine the effects of TPS on peripheral blood Tregs in sepsis mouse induced by burn plus P.aeruginosa infection.Methods: The experimental mice were separated into five groups randomly,including sham burn group,burn plus P.aeruginosa infection group,burn plus P.aeruginosa infection with TPS (50,100,200 mg/kg) treatment group.Peripheral blood Tregs were isolated with Magnetic Microbeads and cultured in vitro from the day after burn(PBD0) to 4 days after burn(PBD4).IL-10,IFN-γ,IL-4 levels in Tregs culture supernatants were determined by sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA).Purification of CD4+CD25highTregs and CD4+T cells in C57BL/6 mice were administrated by magnetic beads sorting.Tregs and CD4+T cells were cultured in vitro after joining TPS to without TPS cells as a control.The phenotypes of Tregs were analyzed by flow cytometry,and cytokines were measured by ELISA.Results: Vis-a-vis the results of the untreated group,TPS could markedly decrease IL-4 and IL-10 secretion level and significantly increase the secretion of IFN-γ,and the secretion of IL-10 level and concentration of TPS dose effect.Vis-a-vis the results of the untreated group,in vitro experiment,without stimulation of TPS,CD4+T cell proliferation and IFN-γ were significantly reduced(P<0.05)and IL-4 levels increased significantly;CD4+T cell proliferation and IFN-γ were significantly increased and IL-4 levels were significantly reduced in the group of TPS with antibody-1;there was no significant difference in CD4+T cell proliferation and the levels of IFN-γ and IL-4 in the group of TPS with antibody-2.Conclusion: TPS could inhibit the abnormal activities of CD4+CD25highTregs in burn with P.aeruginosa infection mice,at least in part via inhibiting IL-10 secretion,and trigger a shift of Th2 to Th1 with activation of CD4+T cells in burn with P.aeruginosa infection mice.

[Key words]Tremella polysaccharides;Tregs;Sepsis;Burn;IL-10

中圖分類號R5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0313-05

通訊作者及指導(dǎo)教師：劉慶陽(1979年-)，男，博士，副研究員，主要從事膿毒癥臨床及基礎(chǔ)研究。

作者簡介：史振偉(1971年-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事腎臟疾病透析治療及基礎(chǔ)研究。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.004

①本文為國家自然科學(xué)基金(81000847，81272140)、中國博士后面上項目(201150M1530)和中國博士后第五批特別資助項目(2012T50863)。

②同時供職于解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍燒傷研究所，北京100048。