何琳琳

(荊門市第一人民醫(yī)院，湖北 荊門　448000)

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130例β-地中海貧血基因突變類型分析

何琳琳

(荊門市第一人民醫(yī)院，湖北 荊門448000)

[摘要]目的：研究分析β-地中海貧血基因突變類型。方法：以2012年4月至2015年1月來我院診治的130例攜帶β-地中海貧血基因患者作為研究對象，采取聚合酶鏈反應以及反向點雜交技術對患者實施基因分型，觀察分析β-地中海貧血患者基因突變情況。結果：130例攜帶β-地中海貧血基因者中，大部分為嬰兒和青少年，有100例為雜合子，6例為純合子，24例為雙重雜合子。突變基因中以TVS-2-654和CD41～42最為常見。結論：β-地中海貧血基因突變類型比較復雜，同時遺傳異質性較為顯著，在今后地中海貧血遺傳咨詢以及產(chǎn)前診斷時，應加強該基因突變類型的檢測以及篩查，從而為優(yōu)生優(yōu)育提供更為合理且全面的指導。

[關鍵詞]突變；β-地中海貧血；基因

所謂β-地中海貧血是指β鏈合成完全被抑制或者部分受抑制的血紅蛋白疾病，多發(fā)于嬰兒期，其中出生后3～6個月發(fā)病者所占比例占1/2。據(jù)調查，該病發(fā)病年齡越早則患者病情越嚴重，需依靠定期輸血維持生命[1-2]。在β-地中海貧血臨床診斷中可結合患者臨床癥狀表現(xiàn)與血液檢查確診。目前在β-地中海貧血臨床中尚無有效治療方法，因此加強產(chǎn)前基因和攜帶β-地中海貧血基因者的篩查、檢查診斷成為目前提升人口素質的有效措施之一[3]。本次研究就本地區(qū)攜帶β-地中海貧血基因者基因突變類型進行研究分析。

1資料和方法

1.1一般資料本次研究血樣來源于2012年4月至2015年1月到本院予以診治的130例攜帶β-地中海貧血基因患者，血樣間沒有親緣關系?；颊咧校耗?0例，女60例；年齡20天至64歲。所有患者或其家屬簽署知情同意書。

1.2主要儀器及試劑血細胞自動分析儀(XS-800i，由日本希美康公司生產(chǎn))、PCR儀(由德國Eppendorf公司生產(chǎn))、ABI30130程序儀(由美國Applied Biosystems公司生產(chǎn))、高效液相色譜儀(由美國BIO-RAD生產(chǎn))、DNA快速提取試劑盒、膠回收試劑盒、β-地中海貧血基因檢測試劑盒以及Taq酶，其中DNA快速提取試劑盒和β-地中海貧血基因檢測試劑盒由深圳益生堂生物企業(yè)有限公司生產(chǎn)，膠回收試劑盒由德國Qiagen公司生產(chǎn)，Taq酶由大連TaKaRa公司生產(chǎn)。

1.3方法采集血樣的時候，對所選對象祖籍和婚姻情況進行考證。采集靜脈血，利用乙二胺四乙酸實施抗凝，且利用DNA快速提取試劑盒進行DNA基因的提取，嚴格按照說明書和操作流程執(zhí)行。檢查診斷主要包含以下2方面：(1)β-地中海貧血基因。采用RDB法(反向斑點雜交)根據(jù)試劑盒操作說明書進行操作，其中PCR反應體系，DNA模板為3 μL，總體積為50 μL，Tap酶為2 μL，含有PCR混合液45 μL。反應條件，94 ℃分別5 min和1 min，55 ℃為30 s，72 ℃分別為60 s和5 min，儲存溫度4 ℃。利用2%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳，查看是否存在特征性條帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)雜交膜條斑點顯色明確基因型，其中正常斑點完全顯色同時未發(fā)生異常突變的斑點一同顯色表示正?；蛐停敉蛔儼唿c和其相應的正常斑點一同顯色則表示基因突變型。(2)罕見β-地中海貧血基因。對于沒有檢測出常見β-地中海貧血突變血樣，對β-珠蛋白基因全長進行擴增。β-珠蛋白引物為上海生工生物工程技術服務有限公司合成。其中PCR反應體系，DNA模板為2 μL，總體積為50 μL，Tap酶為0.5 μL，無菌蒸餾水為36.5 μL，引物為1 μL,含有10×PCR buffer 5 μL。反應條件，95 ℃分別5 min與1 min，55 ℃為30 s，而72 ℃分別為90 s和10 min，儲存溫度為4 ℃。利用1%瓊脂糖凝膠PCR產(chǎn)物進行電泳，查看是否存在目的條帶。對于沒有檢測出常見β-地中海貧血突變的血樣，經(jīng)PCR擴增以及純化以后直接測序，將擴增β-珠蛋白基因全長引物作為測序引物，將提純PCR產(chǎn)物當作模板，借助于DNA全自動序列分析儀實施序列測定，接著基于兩端測出序列。而后設中間段測序引物，并再次實施測序反應，以獲得β-珠蛋白基因者整個全長序列。

1.4統(tǒng)計學方法利用Excel錄入整理研究數(shù)據(jù)，并用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)予以統(tǒng)計學處理和分析。根據(jù)本次研究需求，采取描述性法，分析β-地中海貧血基因突變。

2結果

130例攜帶β-地中海貧血基因者中，年齡在20 d至1歲的有60例，年齡在2～18歲的有40例，超過18歲的有30例。攜帶β-地中海貧血基因者中有100例為雜合子，占76.9%；6例為純合子，占4.6%；24例為雙重雜合子，占18.5%。經(jīng)比較分析，雜合子基因突變所占比重和純合子、雙重雜合子相比較明顯要高(P<0.05)。β-地中?；蛲蛔冾愋皖l率分布與表型如表1所示。

表1　β-地中?；蛲蛔冾愋皖l率分布與表型

注：β0為β珠蛋白肽鏈合成缺失；—表示沒有證實；β+為β珠蛋白肽鏈合成減少

經(jīng)過表1數(shù)據(jù)的分析可知，IVS-2-465和CD41～42出現(xiàn)頻率為最高，其次是CD17、-28，其中IVS-2-465、CD41～42和其他基因突變出現(xiàn)頻率相比較有顯著性差異(P<0.05)。經(jīng)DNA測序，由于β-基因外顯子2-的36位編碼氨基酸缺失一個堿基C，造成蛋白質翻譯終止于第60位，因此出現(xiàn)了一種新基因突變，即CD36。

3討論

在臨床中，β-地中海貧血屬于遺傳性溶血性貧血疾病，該病多發(fā)于嬰兒期，癥狀表現(xiàn)不明顯，隨著年齡的增長，骨骼會發(fā)生變化，出現(xiàn)眼距增寬、特殊面容(頭大、鼻梁低陷、額部突起以及兩顴略高)、眼瞼水腫、生長發(fā)育停滯、皮膚斑狀色素沉著、肝脾大以及食欲不振等現(xiàn)象，大部分患者在5歲之前死亡[4]。經(jīng)研究調查和文獻報道分析認為β-地中海貧血主要是因β-珠蛋白基因存在缺陷所引起，且多為點突變，部分為缺失β-珠蛋白基因。有學者將基因缺失以及點突變造成β鏈生成全部受抑制的叫作β0-地中海貧血，將點突變以及基因缺失造成β鏈生成部分受抑制的叫作β+-地中海貧血[5]。據(jù)調查資料顯示，全球大約有9 000萬人攜帶該病基因，同時每年大約有20萬雙重雜合子或者純合子基因型β-地中海貧血新生兒出生[6]。

本次研究選擇130例攜帶β-地中海貧血基因患者作為研究對象，其中以嬰兒和青少年占多數(shù)。就基因突變情況來看，雜合子患者表型主要為靜止型，即攜帶者，能遺傳給后代，對此，在預防以及控制β-地中海貧血時，需著重加強攜帶血的檢測以及篩查。同時本次研究結果還表明，IVS-2-465和CD41～42突變頻率較高，這2種突變類型比較常見，其中：IVS-2-465突變于內含子第654堿基出現(xiàn)C-T堿基置換，造成mRNA加工發(fā)生異常，使β珠蛋白翻譯受影響；CD41～42突變于β基因41～42 密碼子位置缺失堿基共4個，導致閱讀框架發(fā)生變化，使終止密碼提前出現(xiàn)，造成β珠蛋白鏈合成全部受抑制。對此，在β-地中海貧血疾病預防中，應著重預防IVS-2-465突變與CD41～42突變。除此之外，本次研究還發(fā)現(xiàn)有CD36突變，表明本地區(qū)β-地中海貧血基因突變比較多樣，同時遺傳異質性明顯，從該結果來看，本地區(qū)β-地中海貧血基因多樣性以及明顯異質性具備自身特點。

綜上所述，β-地中海基因突變類型非常多，在疾病控制以及預防過程中，應加強關于地中海貧血方面的知識宣教，加強產(chǎn)前診斷、人群篩查以及遺傳咨詢，降低該病重癥患兒的出生，以此減輕家庭負擔以及社會負擔。除此之外，在今后β-地中海疾病的控制以及預防中，還應注意未知基因突變的檢測以及篩查，獲得更多有關基因多態(tài)性和基因突變遺傳信息，闡明各種基因突變類型病理機理，以此為優(yōu)生優(yōu)育工作的開展提供相應的指導，繼而進一步提升人口素質。

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(收稿日期：2015-07-01)

[中圖分類號]R556.6+1

[文獻標識碼]A

DOI:10.11851/j.issn.1673-1557.2016.02.013

優(yōu)先數(shù)字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1688.R.20160311.2002.002.html

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