甄艷，黎東明,2，黃玉潔,2，谷紅麗,2，吳斌,2

(廣東醫(yī)科大學(xué) 附屬醫(yī)院 1.呼吸疾病研究所; 2.呼吸內(nèi)科，廣東 湛江 524001)

?

4-氨基吡啶抑制肺癌細(xì)胞SPCA1及PC9增殖及其分子機(jī)理的研究

甄艷1，黎東明1,2，黃玉潔1,2，谷紅麗1,2，吳斌1,2

(廣東醫(yī)科大學(xué) 附屬醫(yī)院 1.呼吸疾病研究所; 2.呼吸內(nèi)科，廣東 湛江 524001)

目的 探討4-氨基吡啶(4-AP)對肺癌細(xì)胞增殖的影響及分子機(jī)制。方法 濃度為0、0.195、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25 mmol/L的4-AP分別處理SPCA1和PC9細(xì)胞48 h，MTT法測定4-AP對肺癌細(xì)胞的抑制率及IC50。濃度為0、4.7或0、6.25 mmol/L的4-AP分別處理SPCA1和PC9細(xì)胞0、24、48、72 h或14 d或48 h，MTT法測定肺癌細(xì)胞的增殖率或平板克隆形成實(shí)驗(yàn)測定肺癌細(xì)胞的增殖或流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。濃度為0、3、4.7或0、3.125、6.25 mmol/L的4-AP分別處理SPCA1和PC9細(xì)胞48 h，利用Western blot檢測PI3K/AKT信號通路和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白。結(jié)果 MTT結(jié)果顯示，4-AP 濃度越高，對肺癌細(xì)胞增殖的抑制越強(qiáng)，SPCA1和PC9細(xì)胞的IC50分別為4.7 mmol/L和6.25 mmol/L。MTT法顯示，4-AP組細(xì)胞生長速度減慢(P<0.01)。平板克隆結(jié)果顯示，與對照組相比，4-AP組細(xì)胞平板克隆小且數(shù)量少(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期顯示，4-AP組細(xì)胞G1期比例增多(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，4-AP組細(xì)胞中，P21表達(dá)上調(diào)，p-PI3K (Tyr458)、p-AKT (Ser473)、CCND1和CDK4表達(dá)下調(diào)，PI3K和AKT表達(dá)不變。結(jié)論 4-AP抑制肺癌細(xì)胞生長，且4-AP可能通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路及下游細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。

4-氨基吡啶; 非小細(xì)胞肺癌；生長

近年來肺癌已經(jīng)成為大多數(shù)國家惡性腫瘤死亡的首要原因[1]，5年總體生存率僅為10%左右[2]。手術(shù)治療被認(rèn)為是早中期最有效的治療方法，但由于肺癌早期癥狀大多無特異性，臨床上大部分患者就診時(shí)已確診肺癌晚期，錯(cuò)過手術(shù)的最佳時(shí)期?；熥鳛檩o助治療手段或晚期肺癌的主要治療方法，仍然是不可缺少的手段。因此，尋找有效的化療藥物成為惡性腫瘤治療研究的熱點(diǎn)之一。

4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)，是一個(gè)常用的K+通道阻滯劑，在多種惡性腫瘤中抑制細(xì)胞增殖，包括肝癌[3]、急性髓系白血病[4]和神經(jīng)膠質(zhì)瘤[5]等。因此，4-AP可以看作是一個(gè)治療惡性腫瘤的潛在藥物。本研究采用不同濃度的4-AP與肺癌細(xì)胞體外共培養(yǎng)，然后通過MTT法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，探討4-AP對肺癌細(xì)胞增殖的影響，同時(shí)檢測細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路及下游細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的變化，為4-AP抗癌作用及其機(jī)理研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 肺癌細(xì)胞株 SPCA1、PC9均由南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所方唯意教授饋贈，培養(yǎng)基是含10%(φ)胎牛血清的DMEM，在37 ℃、5%(φ)CO2、飽和濕度的條件下傳代培養(yǎng)，細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司)；胎牛血清(BI公司)；0.25%胰酶(吉諾生物)；4×SDS上樣緩沖液(TAKARA公司)； MTT、DMSO、4-AP (Sigma公司)；細(xì)胞周期檢測試劑盒(碧云天)；磷酸酶抑制劑(申能博彩)；蛋白Marker(Fermantas公司)；RIPA、PMSF蛋白裂解液及增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(碧云天)； CCND1、p-PI3K (Tyr458)、p-AKT(Ser473)、PI3K、AKT、CCND1、CDK4和P21抗體及HRP標(biāo)記的抗鼠、抗兔二抗(Cell Signaling Technology公司)；β-actin抗體(Proteintech公司)。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)；超凈工作臺(蘇凈集團(tuán)安泰公司)；流式細(xì)胞儀(BD公司)；Model 680酶標(biāo)儀、垂直凝膠電泳系統(tǒng)及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜、高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測4-AP對肺癌細(xì)胞增殖的影響

按5 000個(gè)/孔接種細(xì)胞于96孔板中，每組5個(gè)復(fù)孔，每孔體積200 μL，同時(shí)設(shè)空白對照(僅加培養(yǎng)基)。待細(xì)胞貼壁后，棄掉孔內(nèi)原培養(yǎng)液，加入4-AP至終濃度為0、0.195、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25 mmol/L，培養(yǎng)48 h?；蚣尤?-AP至終濃度為0、4.7或0、6.25 mmol/L，培養(yǎng)0、24、48、72 h。每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入DMSO 150 μL，室溫避光搖床振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，以空白對照孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀(λ=490 nm)測定各孔吸光度值(A值)，以相應(yīng)的A值表示細(xì)胞生長能力。各組取平均值，重復(fù)3次，繪制生長曲線。

1.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測4-AP對肺癌細(xì)胞生長的影響

取狀態(tài)良好的細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，于6孔板中按照每孔100個(gè)細(xì)胞接種，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，加入4-AP至終濃度為0、4.7或0、6.25 mmol/L，5%CO237 ℃孵箱培養(yǎng)約14 d，至肉眼清晰可辨的細(xì)胞克隆形成，棄培基，D-hanks清洗3次，空氣干燥；甲醇固定10 min后，棄甲醇空氣干燥；用蘇木素染色5 min，流水緩慢吸取染液，空氣干燥后計(jì)數(shù)形成的克隆數(shù)(≥50個(gè)細(xì)胞為1個(gè)克隆)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測4-AP對肺癌細(xì)胞周期的影響

將狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于6孔板中，每組2個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞匯合度達(dá)60%時(shí)，棄掉孔內(nèi)原培養(yǎng)液，加入4-AP至終濃度為0、4.7或0、6.25 mmol/L，培養(yǎng)48 h；胰酶處理使細(xì)胞分散，用PBS離心洗滌細(xì)胞2次，棄上清，加入1 mL 70%(φ)冰乙醇混勻，固定待用，4 ℃可保存1周，-20 ℃可保存1月；PBS洗滌離心細(xì)胞1次，加入500 mL PBS，25 μL PI(5 ng/mL)及5 μL RNase A染色30 min；冰上避光15 min，上機(jī)檢測。

1.5 Western blot檢測PI3K/AKT信號通路及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的變化

制膠。取30 μg蛋白質(zhì)，用4×SDS上樣緩沖液按3∶1體積比混合，95 ℃水浴變性，加樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫?fù)u床孵育1 h(含3% BSA的TBST溶液)。棄封閉液，分別加入目的蛋白的抗體(1∶1 000)及β-actin鼠抗人單克隆抗體(1∶1 000)，室溫?fù)u床孵育1 h，4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗膜5 min×3次，然后分別按照1∶1 000的比例加入抗兔或抗鼠二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜5 min×3次。ECL化學(xué)發(fā)光檢測與曝光。用Image Lab軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 4-AP對肺癌細(xì)胞SPCA1和PC9的IC50

4-AP對肺癌細(xì)胞的抑制作用呈濃度依賴關(guān)系，SPCA1和PC9細(xì)胞的IC50分別為4.7 mmol/L和6.25 mmol/L(圖1)。

圖1 SPCA1和PC9細(xì)胞經(jīng)不同濃度4-AP處理后的存活率

Figure 1 Effect of 4-AP on the viability of SPCA1 and PC9 cells

2.2 4-AP對肺癌SPCA1和PC9細(xì)胞增殖的影響

與control(不加4-AP細(xì)胞)相比，4-AP組細(xì)胞生長減慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(SPCA1F=330.062,P<0.01；PC9F=3 491.852,P<0.01)(圖2)。

2.3 4-AP對肺癌SPCA1和PC9細(xì)胞克隆形成能力的影響

與control相比，4-AP組細(xì)胞平板克隆小且數(shù)量少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(SPCA1t=5.031，P=0.007；PC9t=6.647，P=0.003)(圖3)。

2.4 4-AP對肺癌SPCA1和PC9細(xì)胞周期的影響

與control相比，4-AP組G1期細(xì)胞比例增多，S期細(xì)胞比例減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(G1∶SPCA1t=-5.373,P=0.006；PC9t=-6.687，P=0.003；S∶SPCA1t=6.916 ，P=0.002；PC9t=5.847，P=0.004)(圖4)。

圖2 4-AP處理SPCA1和PC9細(xì)胞的生長曲線

Figure 2 Effect of 4-AP on the growth curves of SPCA1 and PC9 cells

圖3 4-AP對SPCA1和PC9細(xì)胞平板克隆形成能力的影響

Figure 3 Effect of 4-AP on the colony formation of SPCA1 and PC9 cells

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測4-AP對SPCA1和PC9細(xì)胞周期的影響
Figure 4 Effect of 4-AP on the cell cycle of SPCA1 and PC9 cells

2.5 4-AP對肺癌細(xì)胞SPCA1和PC9的PI3K/AKT信號通路及下游細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響

以β-actin為內(nèi)參，結(jié)果顯示∶與control相比，4-AP組細(xì)胞中，P21表達(dá)上調(diào)，p-PI3K (Tyr458)、p-AKT(Ser473)、CCND1和CDK4表達(dá)下調(diào)，PI3K和AKT表達(dá)不變(圖5)。

1. SPCA1-Ctr; 2. SPCA1-3 mmol/L; 3. SPCA1-4 mmol/L; 4. PC9-Ctr; 5. PC9-3.125 mmol/L; 6. PC9-6.25 mmol/L。

圖5 Western blot檢測4-AP處理SPCA1和PC9后p-PI3K (Tyr458)、p-AKT (Ser473)、PI3K、AKT、CCND1、P21和CDK4蛋白的表達(dá)水平

Figure 5 Effect of 4-AP on the expression of p-PI3K (Tyr458),p-AKT (Ser473),PI3K,AKT,CCND1,P21 and CDK4 in SPCA1 and PC9 cells

3 討論

4-AP是一個(gè)常用的K+通道阻滯劑，抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖[3-5]，但是其在肺癌中功能及具體的分子機(jī)制目前還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)4-AP可能通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路及其下游細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的變化，抑制肺癌細(xì)胞生長，并且抑制細(xì)胞周期G1期到S期轉(zhuǎn)化。

PI3K/AKT是一條經(jīng)典的信號傳導(dǎo)通路，通過影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，可以抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，與人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6-8]。本研究發(fā)現(xiàn)4-AP抑制肺癌細(xì)胞生長，Western blot檢測PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)p-PI3K (Tyr458)和p-AKT (Ser473)表達(dá)下調(diào)，PI3K和AKT表達(dá)不變，提示4-AP可能通過抑制PI3K/AKT信號通路，抑制細(xì)胞生長。

細(xì)胞周期失控可導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。在細(xì)胞周期中存在G1/S轉(zhuǎn)換點(diǎn)(R點(diǎn))，細(xì)胞一旦通過了此限制點(diǎn)，將會自主的完成增殖周期[9]。因此對于調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展關(guān)鍵基因及G1/S轉(zhuǎn)換的研究，將有助于揭示腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。參與調(diào)控細(xì)胞周期的主要分子有∶細(xì)胞周期蛋白(cyclin)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI)。cyclin是細(xì)胞周期核心因子，在G1/S轉(zhuǎn)換中CCND1起重要作用，在受到外源增殖信號刺激時(shí)，其表達(dá)明顯上調(diào)，cyclin與CDK組成復(fù)合體，引導(dǎo)細(xì)胞從G1期通過R點(diǎn)，細(xì)胞周期將自主進(jìn)行。CKI能夠負(fù)性調(diào)節(jié)cyclin-CDK組成復(fù)合體[10]，可阻止細(xì)胞通過R點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)4-AP抑制肺癌細(xì)胞增殖，并且抑制細(xì)胞周期G1期到S期轉(zhuǎn)化，Western blot檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CCND1和CDK4表達(dá)下調(diào)，起負(fù)調(diào)控作用的P21表達(dá)上調(diào)，提示4-AP可能通過下調(diào)CCND1和CDK4的表達(dá)且上調(diào)P21的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞通過G1/S期R點(diǎn)受阻，抑制細(xì)胞生長。

基于上述的研究結(jié)果，明確4-AP通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路及下游細(xì)胞周期相關(guān)蛋白抑制NSCLC細(xì)胞生長，為非小細(xì)胞肺癌的治療提供一些新的思路。

[1] JEMAL A,SIEGEL R,XU Jiaquan,et al. Cancer statistics,2010[J].CA Cancer J Clin,2010,60(5):277-300.

[2] CHEN Wanqing,ZHANG Siwei,ZOU Xiaonong. Estimation and projection of lung cancer incidence and mortality in China[J].Zhongguo Fei Ai Za Zhi,2010,13(5):488-493.

[3] KIM J A,KANG Y S,JUNG M W,et al. Ca2+influx mediates apoptosis induced by 4-aminopyridine,a K+channel blocker,in HepG2 human hepatoblastoma cells[J].Pharmacology,2000,60(2):74-81.

[4] WANG Wei,XIAO Jianbing,ADACHI M,et al. 4- aminopyridine induces apoptosis of human acute myeloid leukemia cells via increasing[Ca2+]i through P2X7 receptor pathway[J].Cell Physiol Biochem,2011,28(2):199-208.[5] HUANG Lianyan,LI Boxing,LI Wenjun,et al. ATP-sensitive potassium channels control glioma cells proliferation by regulating ERK activity[J].Carcinogenesis,2009,30(5):737-744.

[6] ZHEN Yan,LIU Zhen,YANG Huiling,et al. Tumor suppressor PDCD4 modulates miR-184-mediated direct suppression of C-MYC and BCL2 blocking cell growth and survival in nasopharyngeal carcinoma[J].Cell Death Dis,2013,4:e872.

[7] WANG Hao,WU Qiangyun,LIU Zhen,et al. Downregu-lation of FAP suppresses cell proliferation and metastasis through PTEN/PI3K/AKT and Ras-ERK signaling in oral squamous cell carcinoma[J].Cell Death Dis,2014,5:e1155.

[8] ZHEN Yan,LI Dongming,LI Wen,et al. Reduced PDCD4 expression promotes cell growth through PI3K/Akt signaling in non-small cell lung cancer[J].Oncol Res,2016,23:61-68.

[9] HUNTER T,PINES J. Cyclins and cancer.II: Cyclin D and CDK inhibitors come of age[J].Cell,1994,79(4):573-582.

[10] SANDHU C,GARBE J,BHATTACHARYA N,et al. Transforming growth factor beta stabilizes p15INK4B protein,increases p15INK4B-cdk4 complexes,and inhibits cyclin D1-cdk4 association in human mammary epithelial cells[J].Mol Cell Biol,1997,17(5):2458-2467.

(責(zé)任編輯：幸建華)

Inhibition of 4-aminopyridine on cell growth of lung cancer SPCA1 and PC9 cells and its molecular mechanism

ZHEN Yan1,LI Dongming1,2,HUANG Yujie1,2,GU Hongli1,2,WU Bin1,2

(1.InstituteofRespiratoryDiseases,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524001,China; 2.DepartmentofRespiratoryMedicine,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524001,China)

Objective To explore the effect and molecular mechanism of 4-aminopyridine (4-AP) on the proliferation of human lung cancer cells. Methods SPCA1 and PC9 cells were cocultured with 4-AP at different concentrations (0,0.195,0.39,0.78,1.56,3.125,6.25,12.5 and 25 mmol/L) for 48 h and then MTT method was used to determine the inhibition rate of lung carcinoma cells and IC50. SPCA1 and PC9 cells were cocultured with 4-AP at different concentrations (0,4.7 or 0,6.25 mmol/L) for 0,24,48,72 h or 14 d or 48 h,respectively,and then MTT method,colony formation assay and FACS cytometry assay were adopted for detection of the proliferation,growth and cell cycle of lung carcinoma cells.SPCA1 and PC9 cells were cocultured with 4-AP at different concentrations (0,3,4.7 or 0,3.125,6.25 mmol/L) for 48 h,and western blot was used to examine the expression of PI3K/AKT signaling and cell cycle-associated proteins. Results IC50s of 4-AP on SPCA1 and PC9 cells were 4.7 mmol/L and 6.25 mmol/L,respectively.Treatment with 4-AP significantly inhibited the cell growth (P<0.01) and proliferation (P<0.05) of SPCA1 and PC9 cells.4-AP blocked cell cycle transition from G1 to S and G2 phase in PC9 and SPCA1 cells (P<0.05).Meantime,4-AP increased the expression of P21 and decreased the expression of p-PI3K (Tyr458),p-AKT (Ser473),CCND1 and CDK4,whereas total protein levels of PI3K and AKT remained unchanged. Conclusion 4-AP inhibits the proliferation of lung carcinoma cells by modulation of the PI3K/AKT signaling and downstream cell cycle-associated proteins.

4-AP; NSCLC; growth

2016-06-27

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81401906);廣東醫(yī)科大學(xué)附院博士基金(BJ20150003)

甄艷(1984—)，女，博士，助理研究員，Email：yingshuang288@163.com，主要從事肺癌發(fā)病機(jī)制研究；通信作者：吳斌(1962—)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事呼吸疾病研究，Email：wubin621011@126.com。

時(shí)間：2016-09-30 10:22

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160930.1022.004.html

R734.2

A

1006-8783(2016)05-0613-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016062701