姚雪峰，常會(huì)民，邱偉，胡輝華，郭志旺，彭為華

(武警廣東總隊(duì)醫(yī)院 神經(jīng)外科，廣東 廣州 510507)

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microRNA218 在膠質(zhì)瘤的表達(dá)水平及對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響

姚雪峰，常會(huì)民，邱偉，胡輝華，郭志旺，彭為華

(武警廣東總隊(duì)醫(yī)院 神經(jīng)外科，廣東 廣州 510507)

目的 探討microRNA218在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平及對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。方法 收集人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本，運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)microRNA表達(dá)水平，并將其與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)進(jìn)行相關(guān)性分析。采用CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活力。結(jié)果 microRNA218在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)顯著下調(diào)，并與病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)。microRNA218在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過表達(dá)后，細(xì)胞的存活率顯著降低。結(jié)論 microRNA218表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān),microRNA218在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮了重要作用，為了解膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究提供了新的依據(jù)。

microRNA218； 膠質(zhì)瘤； 增殖

據(jù)統(tǒng)計(jì)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中腦腫瘤占90%[1]，其中膠質(zhì)瘤是最常見的腦腫瘤。膠質(zhì)瘤具有高度的侵襲、遷移及增殖能力[2]，但其分子機(jī)制很復(fù)雜。臨床上治療腦腫瘤的方法或藥物非常有限，大多數(shù)診斷為腦膠質(zhì)瘤的患者生存期不到1年，對(duì)于多形性惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，患者的生存率較低[3]。因此，探索腦膠質(zhì)瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找更有效的治療方法和藥物是十分必要的。

microRNA是一類18～25個(gè)核苷酸長度的非編碼單鏈小RNAs，通過調(diào)控特定的有活性的mRNA靶點(diǎn)，在惡性腫瘤的進(jìn)展過程起重要的作用[4-5]。近年來，microRNA218已被在多種腫瘤中廣泛研究[6-7]，其在人腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)下降。然而，microRNA218對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)功能影響的研究較少。本文研究microRNA218在惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其細(xì)胞生物學(xué)功能，以期為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和試劑

膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG、U251MG均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(馬納薩斯，弗吉尼亞州，美國)，并培養(yǎng)在含有10%(φ)胎牛血清(Gibco)的DMEM(Gibco)培養(yǎng)基上，置于37 ℃，5%(φ)CO2恒溫箱(Thermo Fisher)培養(yǎng)。RNAsimple總RNA試劑盒購自中國北京TIANGEN生化科技公司；SYBR Premix ExTaq Ⅱ購自中國大連Takara公司；ABI7500 Real-time PCR system購自美國Applied Biosystems 公司。

1.2 膠質(zhì)瘤組織樣本

膠質(zhì)瘤標(biāo)本均來自于武警廣東總隊(duì)醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除的新鮮膠質(zhì)瘤組織。實(shí)驗(yàn)共收集經(jīng)病理診斷為腦膠質(zhì)瘤的原發(fā)性膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本38例，其中按WHO(World Health Organization)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類[8]Ⅰ級(jí)7例,Ⅱ級(jí)11例,Ⅲ級(jí)10例，Ⅳ級(jí)10例。樣品采集后迅速置于凍存管中液氮保存，6 h后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱備用，用于總RNA的提取。

1.3 microRNA218表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

人microRNA218序列被擴(kuò)增并克隆到pcDNA3.1載體上，構(gòu)建為pcDNA3.1-microRNA218質(zhì)粒。擴(kuò)增microRNA218基因上下游引物的序列見表1。不同量(0.05～0.4 μg)的microRNA218重組質(zhì)粒及空白對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染U87MG和U251MG細(xì)胞，依據(jù)Lipofectamine 2000(Invitrogen)使用說明書完成細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

表1 Quantitative RT-PCR 引物序列Table 1 Quantitative RT-PCR primer sequence

1.4 細(xì)胞活性測(cè)定

使用CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞存活率。將細(xì)胞鋪在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，5 000個(gè)細(xì)胞/孔，加入含10% FBS的DMEM，置于37 ℃，5%CO2恒溫箱培養(yǎng)24 h。然后將質(zhì)粒pcDNA3.1-microRNA218轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。更換為DMEM無血清培養(yǎng)基，并加入0.1%FBS，每孔添加10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)在37 ℃的新培養(yǎng)基中。4 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。將不同濃度(0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 μg)的microRNA218重組質(zhì)粒及空白對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染U87MG和U251MG細(xì)胞，使用CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的存活率。

1.5 RNA提取和實(shí)時(shí)定量RT-PCR

根據(jù)RNAsimple總RNA試劑盒說明書提取總RNA。按照SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis System的說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板，使用SYBR Premix ExTaq Ⅱ在ABI7500 Real-time PCR system上進(jìn)行PCR反應(yīng),記錄熒光定量Ct值(擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù))，以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法，計(jì)算表達(dá)倍數(shù)相對(duì)差異。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 microRNA218水平與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的關(guān)系

運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織樣本中microRNA218的表達(dá)水平，結(jié)果見圖1。圖1 A顯示W(wǎng)HO I 膠質(zhì)瘤患者的microRNA218表達(dá)水平明顯高于WHO Ⅲ和WHO Ⅳ患者(P<0.001)； WHO Ⅱ膠質(zhì)瘤患者的microRNA218表達(dá)水平同樣明顯高于WHO Ⅲ和WHO Ⅳ患者(P<0.01，P<0.05)。microRNA218表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)(圖1Br=-0.965 4，P<0.01)。

2.2 microRNA218對(duì)U87MG和U251MG細(xì)胞增殖的抑制作用

結(jié)果表明在U87MG和U251MG細(xì)胞中，與轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1的對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染 0.15 μg pcDNA3.1-microRNA218質(zhì)粒組的細(xì)胞增殖均顯著下降(圖2)，且下降趨勢(shì)持續(xù)到0.2 μg組，且0.2 μg組細(xì)胞的增殖水平最低。

A.定量RT-PCR檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中microRNA218表達(dá)； B. microRNA218表達(dá)與膠質(zhì)瘤的組織樣本病理分級(jí)的相關(guān)分析。

圖1 microRNA218的表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本病理分級(jí)的相關(guān)性Figure 1 Correlation between microRNA218 expression and pathological grading in glioma tissue samples

與轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01；#P<0.05，##P<0.01。

圖2 U87MG和U251MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染不同量的microRNA218重組質(zhì)粒及空白對(duì)照質(zhì)粒后的細(xì)胞存活率

Figure 2 Viability of U87MG and U251MG glioma cells after transfected with different amounts of microRNA218 or blank pcDNA3.1 plasmids

3 討論

60%的人類基因由microRNA調(diào)控轉(zhuǎn)錄抑制和(或)mRNA降解來調(diào)控[9-10]。越來越多的研究表明，miRNA可以調(diào)控許多基因并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11-12]。一些特異性致病相關(guān)途徑是通過探索腫瘤相關(guān)micorRNAs而發(fā)現(xiàn)。近年來，microRNA218在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮的作用逐漸成為研究的熱點(diǎn)。

microRNA218是一類重要的微小RNA，有兩種編碼基因，即has-microRNA281-1和 has-microRNA 281-2，分別定位于染色體4p15.31的slit2基因和染色體5p35.1的slit3基因的內(nèi)含子中。盡管has-microRNA281-1和 has-microRNA281-2基因的編碼序列不同，但兩種之間具有高度的同源性，兩者轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的pri-miRNA經(jīng)過剪切形成的成熟microRNA218的堿基序列完全相同。microRNA218在哺乳動(dòng)物的許多正常組織中表達(dá)，在腦組織的表達(dá)水平最高[13]。有研究表明microRNA218在鼻咽癌、膀胱癌、胃癌膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)明顯下調(diào)，且與臨床分期負(fù)相關(guān)[14]。在多個(gè)類型的實(shí)體腫瘤組織中恢復(fù)microRNA的表達(dá)水平能夠有效抑制腫瘤的生長。這些研究均提示microRNA218的表達(dá)水平與某些腫瘤的惡性表型密切相關(guān)。本研究檢測(cè)了人膠質(zhì)瘤組織中microRNA218的表達(dá)水平及其與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)microRNA218表達(dá)水平與腫瘤病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，提示microRNA218與膠質(zhì)瘤的進(jìn)展有關(guān)聯(lián)。因此推測(cè)microRNA218可能作為惡性膠質(zhì)瘤的診斷和預(yù)后的一個(gè)有價(jià)值的標(biāo)志物。

He等[15]發(fā)現(xiàn)microRNA218通過調(diào)節(jié)BMI1的表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌的凋亡，Li等[16]證實(shí)microRNA218可以抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，而其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的生物學(xué)作用還尚未被研究。本研究探討了microRNA218對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖功能的影響。CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)分析表明，microRNA218過表達(dá)后兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U87MG和U251MG細(xì)胞)活性顯著被抑制，當(dāng)轉(zhuǎn)染表達(dá)microRNA218的質(zhì)粒量達(dá)到0.2 μg時(shí)，細(xì)胞增殖水平最低。結(jié)果提示與在宮頸癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞一樣，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，microRNA218同樣發(fā)揮了抑制細(xì)胞增殖的作用，而microRNA218通過何種信號(hào)通路發(fā)揮作用還有待于進(jìn)一步探討。

總之，microRNA218表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，microRNA218過表達(dá)可減低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力，本研究為探討膠質(zhì)瘤發(fā)展機(jī)制和治療策略提供了新的思路。

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(責(zé)任編輯：幸建華)

Expression of microRNA218 in glioma and its effect on the biological function of glioma cells

YAO Xuefeng,CHANG Huiming,QIU Wei,HU Huihua,GUO Zhiwang,PENG Weihua

(DepartmentofNeurosurgery,GuangdongProvincialCorpsHospital,ChinesePeopleArmedPoliceForces,Guangzhou510507,China)

Objective To investigate the expression of microRNA218 in glioma and its effect on the biological function of giloma cells. Methods The expression of microRNA218 in human glioma samples was analyzed by quantitative RT-PCR. The correlation between microRNA218 expression and pathological grading in glioma samples was analyzed. Glioma cell viability was detected by the CCK-8 cell counting assay. Results The expression of microRNA218 was significantly downregulated in glioma samples and negatively correlated with the pathological grading. The cell viability was significantly decreased in microRNA218-treated cells when compared with untreated cells. Conclusion The level of microRNA218 is lowered in glioma samples and negatively correlated with the pathological grading,which may provide a reference for study of the pathogenesis of glioma.

microRNA218; glioma; proliferation

2016-07-14

姚雪峰(1968—)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科臨床與基礎(chǔ)研究,Email:doctoryxf@sina.com。

時(shí)間：2016-10-21 15:51:03

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161021.1551.004.html

R739.41

A

1006-8783(2016)05-0643-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016071402