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        microRNA定量檢測方法研究現(xiàn)狀

        2016-04-13 07:18:51陳艷琳王穎芳
        廣東藥科大學學報 2016年5期
        關鍵詞:高通量探針雜交

        陳艷琳,王穎芳

        (廣東藥科大學 中藥學院,廣東 廣州 510006)

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        microRNA定量檢測方法研究現(xiàn)狀

        陳艷琳,王穎芳

        (廣東藥科大學 中藥學院,廣東 廣州 510006)

        MicroRNA(miRNA)是一類由18~24 nt核酸構(gòu)成的非編碼內(nèi)源性小分子RNA,主要參與真核生物的細胞分化、增殖與凋亡等轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn),miRNA與腫瘤、代謝調(diào)控、疾病發(fā)生及診斷等方面有密切的聯(lián)系,因此準確且靈敏地進行miRNA的定量檢測是深入研究miRNA功能的前提。目前,miRNA定量檢測原理主要基于核酸雜交或擴增,包括Northern印跡、微陣列芯片、實時定量PCR、滾環(huán)擴增等。本文通過對傳統(tǒng)miRNA檢測方法、高靈敏度新型miRNA檢測方法進行闡述與分析,為篩選合適的miRNA定量檢測方法提供參考。

        microRNA; 實時定量PCR; 滾環(huán)擴增; Northern印跡

        在現(xiàn)代生物學、醫(yī)學研究中,microRNA(miRNA)是真核生物體內(nèi)必不可少的調(diào)節(jié)因子。多數(shù)成熟miRNA具有高保守性,其可通過與靶mRNA 3′末端非翻譯區(qū)( untranslational region,UTR)完全或不完全堿基配對,使靶mRNA降解或抑制翻譯,進而參與轉(zhuǎn)錄后水平的靶基因表達調(diào)控[1-2]。研究表明,在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中,miRNA可作為一種分子標志物對靶基因介導的信號轉(zhuǎn)導通路進行調(diào)控[3-4],這為miRNA作為新的生物標志因子用于癌癥等重大疾病的早期診斷提供依據(jù),也揭示了miRNA在評估疾病表達水平中的重要性。

        成熟miRNA的表達具有時空特異性、組織特異性[5-6],在生物體內(nèi)能抑制靶mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯等,所以在多種真核生物過程中發(fā)揮著重要作用,尤其在細胞發(fā)育、植物生長等調(diào)控表達尤為突出。隨著對miRNA、siRNA等小分子RNA的大量深入研究,發(fā)現(xiàn)miRNA介導的基因沉默技術在治療及診斷疾病中發(fā)揮著重大作用,研究者運用分子生物信息學分析技術證實miRNA及其靶mRNA的存在[7],至今為止,挖掘出人類基因組中的miRNA已超過1 000種[8]。這使得miRNA定量檢測成為研究miRNA結(jié)構(gòu)及生物學功能的基礎,但因成熟miRNA序列短小,沒有poly(A)尾巴,在細胞內(nèi)低表達,家族成員間序列特異性差等,使miRNA定量檢測難度很大[9-10]。為解決這一難關,近年來建立了多種靈敏度高、特異性強、簡便及高通量的方法,其中基于探針雜交不需要樣本擴增和樣本miRNA擴增是應用最廣泛的兩種方法。在這兩種方法的基礎上,建立多種DNA擴增技術如恒溫滾環(huán)擴增技術、微陣列芯片、探針標記技術以及可克服檢測通量極限等新方法[11]。本文主要對應用廣泛、新型miRNA檢測方法展開論述及分析,以期為研究者進行miRNA研究提供借鑒。

        1 microRNA傳統(tǒng)檢測方法

        1.1 Northern blotting印跡分析

        印跡雜交技術(Northern blotting)是最早應用在miRNA定量檢測的標準方法。該方法運用標記的DNA探針與硝酸纖維素膜上的miRNA進行互補雜交,通過顯影檢測目標條帶[12-13]。Northern blotting印記分析常采用同位素、熒光或納米金標記DNA,此過程操作嫻熟,可探知被檢測miRNA的分子大小、凸顯其豐度,且對儀器要求簡單,因此一直被用于miRNA檢測。但該存在法操作費時費力、耗樣量大、高通量檢測準確度低等缺點。

        鎖核酸( locked nucleic acid,LNA)探針檢測方法顯著彌補了Northern blotting印跡法的缺陷。LNA是一種新的雙環(huán)寡聚核苷酸類似物,通過呋喃環(huán)的2′-O和4′-C不同程度縮水形成亞甲基橋并連接成環(huán)狀的N-構(gòu)象結(jié)構(gòu),可任意摻入到DNA中,使磷酸鹽骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性增加,進而提高miRNA檢測的敏感度和特異性。運用LNA對Northern 印跡雜交技術進行參數(shù)優(yōu)化,已廣泛應用在普通miRNA檢測過程中[14]。

        1.2 微陣列芯片

        微陣列芯片(microarray)是miRNA高通量分析方法的一種,能實現(xiàn)定時定量檢測多個miRNA樣品,在miRNA表達差異譜分析中應用較廣[15]。該方法將多個已知序列的探針與miRNA雜交的芯片固定在固相支持物上,根據(jù)雜交后檢測到的信號強度及數(shù)據(jù)分析,從而構(gòu)建特異miRNA的表達譜。高通量是微陣列芯片檢測miRNA的最大優(yōu)勢,但常伴有假陽性結(jié)果,在基因芯片制作和檢測費用、探針類型及特異性等方面還存在缺點[16],常用于miRNA的初步篩選[17],難以在普通實驗室普及。

        基于微球雜交的流式細胞檢測方法(Bead-based hybridization technology)改善了微陣列芯片的不足,將新載入的微球看作傳統(tǒng)微陣列芯片上的一個點,這一特性不僅有助于捕獲待測靶miRNA,且能避免固態(tài)芯片中的交叉反應。盡管芯片技術能夠?qū)崿F(xiàn)高通量檢測,但在發(fā)現(xiàn)新miRNA的技術支持上比較薄弱,還需進一步的改進。

        1.3 實時熒光定量PCR法(qPCR)

        實時熒光定量PCR是高靈敏檢測低表達miRNA最常見的方法之一[10],尤其針對樣本miRNA表達量低、樣本間基因差異小等情況。該方法是在PCR反應體系中加入特殊的熒光基團,經(jīng)由熒光信號來實時定量觀察PCR的全進程,再根據(jù)標準曲線進行未知模板的定量分析。實時定量PCR一方面可檢測極微量的miRNA基因表達及預測新穎miRNA;另一方面熒光標記核酸化學和寡核苷酸探針雜交技術的發(fā)展,促使qPCR成為定量檢測miRNA的得力手段。目前,利用qPCR技術定量檢測miRNA的方法主要包括莖環(huán)RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)和poly(A)加尾RT-PCR方法。

        1.3.1 RT-PCR

        莖環(huán)RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)可利用莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物對miRNA進行反轉(zhuǎn)錄,用3′末端所含的與miRNA反向互補的莖環(huán)引物進行miRNA片段的逆轉(zhuǎn)錄,新合成miRcDNA可用于實時定量PCR擴增。此莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)引物對成熟的miRNA 3′端具有特異性,能夠?qū)⒍痰膍iRNA擴展,并且具有通用的3′引物位點進行實時PCR。該技術也被認為是先形成一種空間阻礙以阻止對前體miRNA進行PCR引導,再利用實時PCR進行高特異性的定量檢測miRNA的表達水平。因莖環(huán)法特異性好、不需要標記、能夠檢測出低豐度靶mRNA、引物設計過程簡單及精確性高等優(yōu)點,逐漸成為定性檢測miRNA的優(yōu)勢方法。其缺點是實驗材料及儀器較昂貴。

        1.3.2 polyA聚合酶加尾法

        成熟miRNA分子剪接修飾后序列短小,常規(guī)的RT-PCR技術無法實現(xiàn)miRNA的定量或半定量檢測,通常采用poly(A)加尾法進行miRNA的檢測。在poly(A)聚合酶的作用下,miRNA的3′端加上一段寡聚腺苷酸的尾巴,形成一個與mRNA相似的結(jié)構(gòu),再用5′端帶有oligo(dT)的通用引物反轉(zhuǎn)錄生成miRcDNA[18],用于下一步的實時PCR反應。該引物由兩部分組成:一部分為poly(T)12VN(V=A,G,C;N=A,T,G,C),另一部分為通用引物5′-GCGAGCACAGAATTAATAC GAC-3′。與RT-PCR法對比,polyA聚合酶加尾法能一次性進行所有miRNA的加尾反應,檢測特異性及靈敏度都較高;但此方法操作繁瑣,檢測費用較高,且無法實現(xiàn)定量檢測。

        為了克服以上劣勢,poly(U)加尾miRNA檢測方法應運而生[19]。此方法是利用polyU聚合酶在miRNA 3′端添加U的尾巴,逆轉(zhuǎn)錄為miRcDNA,再用通用引物5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′實時定量PCR。與ployA聚合加尾相比,Poly U加尾法是前者方法的擴展和補充,具有更廣泛的適用性,具有良好的特異性及靈敏性,此方法為miRNA的檢測分析及分子機制研究提供了良好的應用前景。

        2 microRNA檢測新方法

        2.1 納米粒子(Nano String)讀數(shù)技術

        納米粒子讀數(shù)技術是利用等離子體共振成像(SPRI)技術[20]及表面聚合反應進行miRNA檢測。首先用一個連接序列與待檢測的miRNA特異性結(jié)合,將此復合物與單鏈LNA標記的捕獲探針和納米金標記的核酸信號探針(約30個堿基T組成)雜交,經(jīng)由SPRI技術檢測分析,獲得讀數(shù)?;诩{米材料良好導電性,能使電子在生物分子和電極表面自由移動的原理,納米材料讀數(shù)技術的miRNA電檢測研究獲得了理想的結(jié)果。

        Yin[21]等將生物素標記的單鏈信號DNA與鎖核酸固定在納米金上,形成生物素標記探針,將電極上的發(fā)卡探針與miRNA特異性雜交,并把生物素探針和鏈霉親和素標記辣根過氧化氫酶加入到體系中,然后進行酶學擴增信號的檢測,建立了靈敏度極高的miR-21電化學檢測miRNA法。Dong等[22]將帶有耦合Hg2+的分子信標(MB)與作為熒光基團的Ag納米簇(AgNCs),在核酸內(nèi)切酶的輔助下進行的擴增反應應用到miRNA的檢測,不僅避免復雜的溫度控制及標記,且大大提升miRNA檢測限。隨著對miRNA檢測技術的深入探索,發(fā)現(xiàn)將光學檢測與納米粒子檢測聯(lián)用可使生物樣品檢測靈敏度和檢測范圍極大地提高。Alhasan等[23]研發(fā)出一種針對低表達量miRNA的Scanometric miRNA檢測方法,其檢測靈敏度及檢測范圍都較強。首先,以T4 RNA連接酶2為介導,將miRNA與通用DNA分子連接,與miRNA微陣列雜交后,利用通用球狀核苷酸化的AuNPs捕獲雜交的微陣列miRNA,再利用金沉積擴增、成像。

        納米粒子讀數(shù)技術可實現(xiàn)miRNA檢測的高靈敏度、高通量、高特異性等要求,無需序列擴增和逆轉(zhuǎn)錄,可實時檢測。但納米粒子易受外界溶液PH或離子強度的影響。此外,探針密度也會影響特異性雜交效率,因此在選擇納米技術檢測miRNA時要盡量規(guī)避上述問題。

        2.2 基于RCA檢測方法

        滾環(huán)擴增技術(rolling circle amplification,RCA)是一種恒溫核酸擴增方法。設計的引物與環(huán)狀DNA分子連接后,聚合酶將連續(xù)復制出無數(shù)個環(huán)的互補序列拷貝,這是與PCR差異之處。該方法可在短時間內(nèi)使目標miRNA分子數(shù)量倍增,使檢測信號放大,反應過程無需特殊儀器設備,可廣泛地應用在RNA、DNA和蛋白質(zhì),尤其miRNA的定量檢測分析[24]。

        Jonstrup等[25]首次把RCA技術應用到miRNA檢測上,該研究將miRNA做為連接模板與探針連成環(huán),并作為引物在聚合酶的作用下引發(fā)RCA反應。一些研究者在此基礎上,改進RCA擴增技術,使miRNA檢測靈敏度及特異性大大提升。Cui等[26]建立滾環(huán)-循環(huán)酶雙擴增法(RCA-CEAM),即將RCA與CEAM(循環(huán)酶擴增)聯(lián)用檢測miRNA表達,使檢測靈敏度大大地提高至12fm。Ge等[27]設計滾環(huán)擴增-熒光原位檢測法(TPRCA-FISH),該方法是基于靶細胞引發(fā)的滾環(huán)擴增,以circular DNA為探針與靶miRNA結(jié)合,然后miRNA游離的3′末端發(fā)生RCA反應,進而擴增產(chǎn)物與熒光探針原位雜交。該方法產(chǎn)生的雜交信號很強,且易與背景信號區(qū)分,能夠簡便快速地檢測低豐度表達的miRNA。Wen等[28]將RCA、切口酶信號擴增及DNA酶信號擴增結(jié)合起來,使miRNA定量檢測水平提升至2 amol/L。Liu等[29]將鎖探針-RCA與切口酶信號擴增技術聯(lián)用,設計出P-ERCA法(padlock probe-based exponential RCA),RCA擴增檢測的效率進一步提高,使miRNA在高通量分析中更加精確。

        盡管滾環(huán)擴增技術特異性強、檢測范圍廣、可區(qū)分miRNA單堿基的差異,在構(gòu)建miRNA高通量檢測的微陣列上也有獨特的優(yōu)勢,但該法擴增耗時長、工具酶價格昂貴、RCA模板合成難度大,故在miRNA定量檢測的應用中并不常見。

        2.3 基于酶信號放大的電化學檢測

        根據(jù)酶具有催化作用,可使單個雜交分子轉(zhuǎn)變成大量的檢測分子的特性,可將酶作為生物分析的標簽,這一特性使基于酶的電化學檢測越來越多的應用到miRNA檢測中。Pohlmann等[30]設計了一種間斷雜交檢測miRNA的電化學方法,采用DNA/RNA雜交鏈及酯霉素-2-脫氧核苷酸(EST-2-ODN)作為化學檢測標志物,進行miRNA的定量檢測。此方法依據(jù)互補原則將miRNA與檢測核苷酸固定在探針上,使用標記酶與之雜交。Lin等[31]將第三代E-DNA傳感器應用到miRNA檢測,其中具莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA的熱力學穩(wěn)定性使背景信號降低,增強反應特異性,再使用生化酶進行電化學信號擴增。此方法在區(qū)分高保守性的miRNA家族成員上有極大優(yōu)勢。Deng等[32]將靶標miRNA與綁定在特殊磁珠上的探針(DZ-CPs)雜交,再使用特異性核酸酶切割,通過磁鐵將未反應的DZ-CPs及磁珠去掉,以余下溶液中的DNA分子看作催化劑,在過氧化氫的存在下催化3,3′,5,5′-聯(lián)苯胺,再采用比色法進行高靈敏度檢測。

        酶信號擴大檢測miRNA雖滿足了高靈敏度、高特異性等要求,但仍存在擴增模板序列設計不易成功、背景信號高等缺陷,故酶輔助miRNA的電化學檢測法仍需大力改進。

        2.4 測序法[33]

        以上關于miRNA的檢測均是用于單個且已知序列miRNA的測定,無法對未知序列的miRNA進行檢測。新一代大規(guī)模測序、miRNA芯片、克隆和Nano String讀數(shù)等可用于特定樣品中的miRNA種類及特定miRNA的表達分析,但樣品必須先進行擴增才能開展測序檢測,然后根據(jù)miRNA的表達豐度定量分析。

        2.4.1 克隆測序

        克隆測序法是預測新miRNA最古老的方法之一,此方法要先抽提RNA,進行RT-PCR擴增,構(gòu)建miRNA的cDNA文庫,然后把擴增產(chǎn)物克隆到表達載體上深度測序。獲得大批量的Raw data序列,與各數(shù)據(jù)庫比對進行miRNA的定量檢測,進而鑒定新miRNA。

        為提高直接克隆的靈敏度,Takada 等[34]建立了新型擴增克隆法(miRNA amplification profiling,mRAP),該法系將miRNA的3′端與接頭相連,然后用與接頭反向互補的引物反轉(zhuǎn)錄。因特定的反轉(zhuǎn)錄酶具有末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性,一些核苷酸(主要是脫氧胞苷酸dC)會連接到反轉(zhuǎn)錄中的cDNA鏈的3′末端。當5′端接頭與cDNA鏈的poly(C)粘性末端退火后,加入一對通用引物即可實現(xiàn)對cDNA的PCR擴增。mRAP靈敏度比較高,因此可直接用克隆和測序技術檢測少量組織中miRNA 的表達量。Cummins等[35]在基因表達系列分析(SAGE)技術的基礎上研發(fā)了檢測效率較高的miRAGE(miRNA SAGE)克隆法,即標簽序列克隆。該法先要給miRNA分子連上特定的接頭,以便用生物素標記的引物進行反轉(zhuǎn)錄,接頭經(jīng)過酶切后用鏈親和素包被的磁性微球移除,然后按照優(yōu)化了的SAGE法進行釋放標簽的串聯(lián)、克隆和測序。

        克隆測序法可直觀可靠的檢測miRNA表達,是檢測未知miRNA序列最常用的方法之一,但對低表達量或組織及細胞特異性的miRNA較難檢測,且耗樣量大、操作繁瑣等劣勢,如今已逐漸被新的檢測方法所取代。

        2.4.2 新一代測序技術[36]

        新一代測序技術始于1987年ABI公司推出的用于繪制人類基因組圖譜的Sanger法。自2005年以來,新一代高通量測序技術取得突飛猛進的發(fā)展,目前,運用新一代測序技術可從轉(zhuǎn)錄組測序水平、small RNA測序水平、降解組測序水平等多角度進行功能差異基因表達、miRNA檢測及遺傳物質(zhì)的全面分析,亦可從基因組水平、轉(zhuǎn)錄組水平、蛋白質(zhì)水平等全方位解析分子生物學功能,是具遠大發(fā)展前景的miRNA檢測技術[37]。

        新一代高通量測序技術首推羅氏公司的454焦磷酸測序技術、Il-lumina公司的Solexa基因組測序。這兩者都能定性、定量檢測miRNA的基因表達水平,不僅可檢測已知miRNA長度和序列的微小改變,亦可檢測出miRNA的表達豐度,也是挖掘新miRNA的重要工具。兩種測序方法在測序原理、數(shù)據(jù)量及數(shù)據(jù)質(zhì)量、成本方面雖有差異,但測序步驟基本相同,主要包括:樣品的制備、模板準備、測序及成像、small RNA序列組裝和比對等[38]。其中,454測序技術利用微乳滴PCR進行擴增,將連接得到的每一片段分別與微球結(jié)合,使微球在含有PCR反應體系的油滴中獨立擴增。將微球中的雙鏈DNA進行變性得到帶有單鏈DNA的微珠,再加入到排列有微升級小孔的檢測板中,對微球上片段進行基于焦磷酸鹽的測序。而Solexa測序技術[39]的原理基于邊合成邊測序,使用橋式PCR來擴增,是唯一不采用傳統(tǒng)聚合酶進行測序的方法,與前者最大的區(qū)別在于以4種不同熒光基團分別標記16種寡聚核苷酸片段,加入測序引物進行連接反應。

        454測序技術因操作簡單且一次測序可檢測到200~300 nt長度序列的優(yōu)勢,在尋找新miRNA和轉(zhuǎn)錄組測序中占據(jù)著重要地位。但此法在進行miRNA定量檢測時要依賴一系列的酶,增大了檢測的假陽性。Solexa基因組分析儀在每次引物延伸過程中都會摻入一個堿基,導致基因錯配的幾率加大,但在50 bp讀長范圍內(nèi),Solexa測序儀的準確率高達99%以上,這一特性使之成為與qRT-PCR方法并駕齊驅(qū)的新穎miRNA檢測方法。

        2.5 Agilent 2100 Bioanalyzer[40]

        Agilent 2100 Bioanalyzer技術是以生物芯片核酸分析系統(tǒng)(簡稱Bioanalyzer)為原理進行miRNA定量檢測,采用高靈敏度的熒光檢測系統(tǒng)可在一定程度上克服瓊脂糖凝膠電泳的局限性和誤差。

        Agilent 2100 Bioanalyzer檢測miRNA需先構(gòu)建cDNA文庫,通過特異性引物的介導,以cDNA為模板,進行PCR反應。按照DNA 7500 LabChip試劑盒所提供的說明制備凝膠染料及芯片,將PCR產(chǎn)物加入到芯片樣品孔后,渦旋震蕩放入Agilent 2100 Bioanalyzer中進行自動檢測分析。該法在準確度、重復性上有獨特的優(yōu)勢,如:①耗時短:在分離管道和高電場的應用下,30 min內(nèi)就可完成若干個miRNA的連續(xù)自動化分析;②操作簡便:與瓊脂糖凝膠電泳不同,Agilent 2100 Bioanalyzer無需進行凝膠制備、跑電泳、染色、成像等,也不用進行繁瑣的數(shù)據(jù)分析;③樣品用量少:以微小樣品消耗量進行檢測,可實現(xiàn)miRNA的微量化;⑤安全高效:最大限度地減少危害物質(zhì)的接觸(如EB),并減少廢物量。鑒于以上優(yōu)點,Agilent 2100 Bioanalyzer芯片分析系統(tǒng)和PCR特異性反應結(jié)合,在miRNA的檢測和鑒定中具有巨大的發(fā)展前景。

        表1 幾種miRNA檢測方法的特點及靈敏度Table 1 Characteristics and sensitivity of several miRNA detection methods

        3 小結(jié)與展望

        建立理想的miRNA定量檢測分析方法,將有助于研究miRNA的高度保守性、時空特異性等生物學功能,使得miRNA為疾病診斷和生物醫(yī)藥制劑的研發(fā)帶來新契機。目前,miRNA定量檢測方法的建立主要依賴各種探針設計和標記技術,與微陣列芯片、實時熒光定量PCR、高通量測序等技術聯(lián)用來提高檢測靈敏度和特異性。隨著Q-PCR分析服務的可靠和直觀性,越來越多的研究者選用此法進行miRNA表達水平的驗證分析,同時,新一代測序技術成本不斷降低,運用測序分析儀進行miRNA高通量建庫檢測技術迅速發(fā)展,近年建立起以調(diào)控基因表達的靶mRNA或以miRNA為檢測疾病的構(gòu)想,已成為未來研發(fā)的熱點。與傳統(tǒng)的miRNA檢測方法相比,新一代測序技術、RCA等檢測方法憑借高通量、高質(zhì)量、高準確度、可重復性等優(yōu)勢,普遍應用于新 miRNA預測、篩選差異表達功能基因、miRNA靶基因的預測及miRNA異構(gòu)體檢測等方面。但每種方法也有不可忽略的缺陷,故往往要根據(jù)實驗目的及檢測方法的優(yōu)劣勢或多種方法聯(lián)用以選擇合適的miRNA檢測方法。相信隨著轉(zhuǎn)錄組測序、small RNA測序、降解組測序及蛋白基因組學等技術的發(fā)展,大規(guī)模的miRNA定量檢測技術將會更廣泛地應用在分子生物學研究中。

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        (責任編輯:王昌棟)

        Current research in methods for the quantitative detection of microRNA

        CHEN Yanlin,WANG Yingfang

        (SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

        MicroRNA(miRNA) is a kind of non-coding endogenous small molecule RNA,which is composed of 18-24 nt nucleic acid. It is mainly involved in the regulation of cell differentiation,proliferation and apoptosis. Mature miRNA sequence is short,highly conservative,stability and other characteristics,which increases a lot of difficulties for accurate detection of miRNA levels. miRNA quantitative detection principle is mainly based on nucleic acid hybridization or amplification,including Northern bloting,microarray chip,real-time quantitative PCR,rolling ring amplification,etc. Through the analysis of the advantages and disadvantages of the existing miRNA detection technology in recent years,this paper will provide a reference for screening suitable miRNA quantitative detection method.

        microRNA; quantitative PCR; rolling ring amplification; Northern bloting

        2016-08-24

        國家自然科學基金青年基金項目(81403195);廣東省自然科學基金項目(S2013010015418)

        陳艷琳(1991—),女,2014級碩士研究生,Email:944589543@qq.com;通信作者:王穎芳(1975—),女,副教授,從事中藥方劑學研究,Email:150306757@qq.com。

        時間:2016-10-08 11:45

        http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161008.1145.003.html

        Q522

        A

        1006-8783(2016)05-0666-06

        10.16809/j.cnki.1006-8783.2016082402

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