呂小輝，孫佳瑜，蔡智剛，張瑞鵬，單愛云

(1.深圳市福田區(qū)中醫(yī)院，廣東 廣東 518033； 2.深圳清華大學(xué) 研究院，廣東 廣州 518067)

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六味地黃丸含藥血清對Eahy926細(xì)胞ERK/Nrf2-HO-1信號通路的影響

呂小輝1，孫佳瑜1，蔡智剛1，張瑞鵬2，單愛云1

(1.深圳市福田區(qū)中醫(yī)院，廣東 廣東 518033； 2.深圳清華大學(xué) 研究院，廣東 廣州 518067)

目的 觀察六味地黃丸含藥血清對人血管內(nèi)皮細(xì)胞Eahy926增殖及其ERK/Nrf2-HO-1信號通路的影響。方法 CCK-8檢測大鼠5%、10%、20%空白血清與5%、10%、20%含藥血清對Eahy926細(xì)胞增殖的影響，并用Western-blotting方法檢測10%含藥血清對Eahy926細(xì)胞ERK/Nrf2-HO-1信號通路分子蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 六味地黃丸含藥血清可以促進(jìn)Eahy926細(xì)胞的增殖；在Eahy926細(xì)胞中，10%六味地黃丸含藥血清能夠促進(jìn)ERK的磷酸化、Nrf2核轉(zhuǎn)位和HO-1蛋白的表達(dá)，明顯高于無大鼠血清組和10%空白血清組。結(jié)論 10%六味地黃丸含藥血清誘導(dǎo)ERK磷酸化介導(dǎo)Nrf2入核和HO-1蛋白的表達(dá)。

六味地黃丸； 血管內(nèi)皮細(xì)胞； ERK/Nrf2-HO-1； 蛋白表達(dá)

血紅素加氧酶(HO)是哺乳動物內(nèi)源性保護(hù)酶，是體內(nèi)血紅素代謝的起始酶和限速酶，主要將血紅素代謝成膽綠素、一氧化碳和游離的鐵離子。HO在體內(nèi)有HO-1、HO-1、HO-3 3種同工酶，其中HO-1為可誘導(dǎo)型HO，參與體內(nèi)眾多抗氧化事件。血紅素加氧酶-1(HO-1)表達(dá)需要其核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2激活后入核與相應(yīng)的啟動子結(jié)合，Nrf2的激活與ERK的磷酸化有著密切關(guān)系，磷酸化的ERK可以促進(jìn)Nrf2激活，與封閉蛋白解離入核，進(jìn)而促進(jìn)HO-1蛋白的表達(dá)。以往研究發(fā)現(xiàn)六味地黃丸含藥血清[1]和激活ERK/Nrf2-HO-1信號通路[2]都具有血管內(nèi)皮保護(hù)作用，推測六味地黃丸含藥血清可能具有激活ERK/Nrf2-HO-1信號通路的作用。本研究主要觀察六味地黃丸含藥血清在血管內(nèi)皮細(xì)胞上對ERK/Nrf2信號通路是否有調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量180～220 g，廣州醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2013-0002。

1.1.2 藥物 六味地黃丸購于北京同仁堂，批號20150415，取六味地黃丸100丸(每8丸相當(dāng)于生藥材量3 g)，機(jī)械粉碎成粗粉，加入50 mL蒸餾水混勻，濃縮至1.56 kg/L的藥液。

1.1.3 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)；胎牛血清(PAN)；0.25%胰酶(Hyclone)；BCA蛋白定量試劑盒和CCK-8試劑盒(碧云天科技有限公司)；RIPA蛋白裂解液(Solarbio)；ERK和p-ERK一抗(SatanCruz)；Nrf2和HO-1一抗(abcam)；β-actin和所有的二抗(中杉金橋)；U0126(CST)。

1.1.4 主要儀器 Forma-371型CO2培養(yǎng)箱(Thermo)；5418R型低溫冷凍離心機(jī)(Effendorf)；EN12469型超凈工作臺(ESCO)； A2LED型倒置顯微鏡(Zeiss)；elx-808型全自動酶標(biāo)儀(Biotek)。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清制備 將SD大鼠隨機(jī)分為空白組和六味地黃丸給藥組，每組各10只，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定給藥組生藥濃度為1.56 kg/L六味地黃丸混懸液，10 mL/kg灌胃，每天1次，空白組給予同體積生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥3 d，第4天給藥后2 h心臟取血，4 ℃冰箱過夜，5 000 r/min離心5 min分離血清，56 ℃水浴30 min滅活補(bǔ)體，超濾滅菌，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Eahy926細(xì)胞培養(yǎng) 人血管內(nèi)皮細(xì)胞株Eahy926，在含10%(φ)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5%(φ)CO2、37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)。

1.2.3 含藥血清對Eahy926細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞生長融合度80%以上，消化細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，以5×107cells/mL單細(xì)胞懸液100 μL接種于96孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長融合度達(dá)80%時，使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基同步化24 h，將細(xì)胞分為無大鼠血清組、正常大鼠血清(NS)組(5%、10%、20%)和給藥大鼠血清(MS)組(5%、10%、20%)每組設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，加入CCK-8試劑37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h后，用酶標(biāo)儀在490 nm波長下檢測每孔細(xì)胞吸光度值(A值)。

1.2.4 細(xì)胞蛋白提取和Western blotting檢測[3]用預(yù)冷的PBS清洗培養(yǎng)皿3次，用預(yù)冷的RIPA蛋白裂解液刮取細(xì)胞，冰上裂解15 min后，14 000 r/min離心15 min，取上清。從上清中取少量按照BCA蛋白定量試劑盒定量后，用上樣緩沖液將所有樣品調(diào)制相同濃度，混勻100 ℃變性5 min，分裝凍存。蛋白上樣20 μL，垂直電泳跑膠，積層膠電壓為80 V，分離膠電壓為110 V，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜至NC膜上，脫脂奶粉封閉，一抗過夜，洗膜后二抗孵育，加顯影液凝膠成像曝光。

1.2.5 含藥血清對HO-1表達(dá)的作用 將細(xì)胞鋪于直徑60 mm的平皿中，分為無大鼠血清組、正常大鼠血清組[U1]和給藥大鼠血清組，正常大鼠血清組和給藥大鼠血清組分別用10%的正常大鼠血清和10%給藥大鼠血清孵育細(xì)胞48 h，提取細(xì)胞蛋白，用Western blot檢測HO-1蛋白的表達(dá)。

1.2.6 含藥血清對Nrf2轉(zhuǎn)位的作用 將細(xì)胞鋪于直徑60 mm的平皿中，分為無大鼠血清組、正常大鼠血清組和給藥大鼠血清組，正常大鼠血清組和給藥大鼠血清組分別用10%的正常大鼠血清和10%含藥大鼠血清孵育細(xì)胞48 h，提取細(xì)胞核蛋白，用Western blot檢測Nrf2蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測不同濃度的含藥血清對Eahy926細(xì)胞增殖的影響

表1結(jié)果提示，與無大鼠血清組比較，3個濃度給藥大鼠血清組和10%、20%的正常大鼠血清組吸光度值明顯增高(P<0.05)；這說明給藥大鼠血清和10%、20%的正常大鼠血清能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖；10%、20%的無大鼠血清組與同濃度的給藥大鼠血清組比較吸光度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，5%給藥大鼠血清組與5%正常大鼠血清組吸光度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 CCK-8法測定各組Eahy926細(xì)胞A值

組別正常大鼠血清給藥大鼠血清無大鼠血清組0.54±0.120.55±0.145%血清組0.56±0.140.79±0.13*#10%血清組0.71±0.15*0.81±0.15*20%血清組0.83±0.16*0.83±0.17*

與無大鼠血清組比較：*P<0.05；與5%正常大鼠血清組比較：#P<0.05。

2.2 含藥血清對HO-1表達(dá)的作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，給藥大鼠血清能夠誘導(dǎo)HO-1蛋白的表達(dá)，并具有劑量依賴性，與無大鼠血清組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；10%正常大鼠血清對HO-1的表達(dá)沒有作用，與無大鼠血清組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

Con10%NS5%MS10%MS20%MSHO-1β-actin3.53.02.52.01.51.00.50HO-1/β-actin*****Con10%5%10%20%NSMS

與無大鼠血清組比較：*P<0.05，**P<0.01。

圖1 含藥血清在Eahy926細(xì)胞上對HO-1表達(dá)的影響

2.3 含藥血清對Nrf2轉(zhuǎn)位的作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，10%給藥大鼠血清能夠促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2核轉(zhuǎn)位，與無大鼠血清組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；10%正常大鼠血清對核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2核轉(zhuǎn)位沒有作用，與無大鼠血清組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

2.4 含藥血清誘導(dǎo)ERK磷酸化介導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位和HO-1表達(dá)的作用

如圖3A所示，10%給藥大鼠血清能夠明顯誘導(dǎo)ERK的磷酸化，與無大鼠血清組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而10%正常大鼠血清不能誘導(dǎo)ERK的磷酸化，如圖3B，3C所示加入ERK磷酸化特異抑制劑U0126后，U0126阻斷了10%給藥大鼠血清誘導(dǎo)Nrf2的核轉(zhuǎn)位和HO-1的表達(dá)。以上結(jié)果提示，10%給藥大鼠血清誘導(dǎo)ERK的磷酸化介導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位和HO-1表達(dá)。

**Con10%NS10%MSNrf2(Nucleus)β-actin3.53.02.52.01.51.00.50Nrf2/β-actinCon10%NS10%MS

與無大鼠血清組比較：**P<0.01。

圖2 含藥血清在Eahy926細(xì)胞上對Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞是覆蓋在血管內(nèi)層的一層細(xì)胞，是循環(huán)血液與血管平滑肌的機(jī)械屏障，具有多種生理功能，參與機(jī)體的凝血、免疫、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和生物活性物質(zhì)釋放等生命活性，血管內(nèi)皮損傷是心血管疾病的病理基礎(chǔ)，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，對減少心血管疾病意義重大。以往研究表明，HO-1對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[4 ]，減少血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[5]，對抗內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激[6]，修復(fù)內(nèi)皮損傷[7]。HO-1表達(dá)與其轉(zhuǎn)錄因子Nrf2入核密切相關(guān)，對HO-1的表達(dá)發(fā)揮重要的作用，基礎(chǔ)狀態(tài)下Nrf2與Keap-1偶聯(lián)在一起，以非活化的形態(tài)存在于細(xì)胞之中，在啟動因素刺激下，Nrf2被激活與Keap-1解偶聯(lián)，進(jìn)入細(xì)胞核與ARE相互作用，啟動HO-1基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)HO-1的表達(dá)。以往的研究顯示，ERK信號通路的激活與Nrf2的活化入核有著密切的關(guān)系[8]，一些自然產(chǎn)物能夠活化ERK促使Nrf2磷酸化入核，與核內(nèi)相應(yīng)啟動子結(jié)合，增加HO-1的表達(dá)[9-10]。

**10%MS10%NSConp-ERKERK2.01.51.00.50P-ERK/ERKCon10%NS10%MS+-+-++--0.70.60.50.40.30.20.10HO-1/β-actinMS(10%)U0126HO-1β-actin**##Con10%MS10%MS+U0126U0126AC**##MS(10%)U0126Nrf2β-actin+-+-++--1.41.21.00.80.60.40.20Nrf2/β-actinCon10%MS10%MS+U0126U0126B

A. 10%給藥大鼠血清對ERK磷酸化的作用(與無大鼠血清組比較：**P<0.01)； B. ERK磷酸化抑制劑U0126阻斷10%給藥大鼠血清促進(jìn)Nrf2表達(dá)的作用(與無大鼠血清組比較：**P<0.01; 與U0126組比較:##P<0.01); C. ERK磷酸化抑制劑U0126阻斷10%給藥大鼠血清促進(jìn)HO-1表達(dá)的作用(與無大鼠血清組比較：**P<0.01; 與10%給藥大鼠血清組比較：##P<0.01)。

圖3 含藥血清在Eahy926細(xì)胞上誘導(dǎo)ERK磷酸化介導(dǎo)Nrf2入核和HO-1蛋白

六味地黃丸組方源于宋代醫(yī)學(xué)家錢乙的《小兒藥證直決》是滋補(bǔ)腎陰的基礎(chǔ)方劑配伍組方上具有“三補(bǔ)三瀉”的特點(diǎn)，主要由熟地、澤瀉、山萸肉、丹皮、山藥、茯苓六味中藥組成，具有滋陰益腎的作用，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)六味地黃丸具有抗癌、增加細(xì)胞免疫性、調(diào)節(jié)血壓血脂[11]、降低血糖、血脂、抗氧化等作用[12]，而六味地黃丸含藥血清對HO-1表達(dá)及上游ERK/Nrf2信號通路的研究報道很少。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)5%六味地黃丸的給藥血清能夠?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞Eahy926增殖有促進(jìn)作用，與對照組和空白血清組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時發(fā)現(xiàn)10%六味地黃丸含藥血清能夠促進(jìn)ERK的磷酸化，并且使用ERK磷酸化的特異抑制劑U0126能夠阻斷ERK的磷酸化，同時也阻斷10%六味地黃丸含藥血清對HO-1的誘導(dǎo)表達(dá)和轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的入核，結(jié)果提示，10%六味地黃丸含藥血清誘導(dǎo)ERK磷酸化介導(dǎo)Nrf2入核和HO-1蛋白的表達(dá)。本文只是初步探討了10%六味地黃丸含藥血清對ERK/Nrf2-HO-1信號通路的調(diào)節(jié)作用，六味地黃丸含藥血清是否通過ERK/Nrf2-HO-1信號通路對損傷血管內(nèi)皮發(fā)揮保護(hù)作用，還需要進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：幸建華)

Effect of drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills on the ERK/Nrf2-HO-1 signaling pathway in Eahy926 cells

LYU Xiaohui1,SUN Jiayu1,CAI Zhigang1,ZHANG Ruipeng2,SHAN Aiyun1

(1.ShenzhenFutianDistrictTraditionalChineseMedicineHospital,Guangdong518033,China; 2.KeyLabforNewDrugsResearchofTCM,ShenzhenResearchInstituteofTsinghuaUniversity,Shenzhen518067,China)

Objective To investigate the effect of drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills on the ERK/Nrf2-HO-1 pathway in Eahy926 cells. Methods The proliferation of Eahy926 cells was detected by CCK-8 method. Western blotting was used to determine the protein expression of the ERK/Nrf2-HO-1 pathway. Results The drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills promoted the proliferation of Eahy926 cells. The levels of ERK phosphorylation,Nrf2 nuclear translocation and HO-1 expression in Eahy926 cells treated with 10% drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills were significantly higher than that of the control and blank groups. Conclusion 10% drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills promotes Nrf2 nuclear translocation and expression of HO-1 via inducing ERK phosphorylation.

Liuwei Dihuang pills; vascular endothelial cells; ERK/Nrf2-HO-1 signaling; protein expression

2016-05-10

深圳市科技研發(fā)基金(JCYJ20140414145007216)

呂小輝，女，主管藥師，主要從事臨床藥學(xué)研究，Email:22181265@qq.com；通信作者：單愛云，女，主任藥師，主要從事藥事管理研究，Email:253010652@qq.com。

時間：2016-09-30 9:39

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160930.0939.001.html

R285.5

A

1006-8783(2016)05-0618-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016051001