李麗姣,陳永剛,張柯達(dá),陳敏,何晶

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,湖北 武漢 430065； 2.武漢市第三醫(yī)院 藥學(xué)部,湖北 武漢 430060)

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麥芽生物堿物質(zhì)提取工藝優(yōu)化及不同產(chǎn)地含量比較

李麗姣1,陳永剛2,張柯達(dá)2,陳敏2,何晶1

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,湖北 武漢 430065； 2.武漢市第三醫(yī)院 藥學(xué)部,湖北 武漢 430060)

目的 優(yōu)選麥芽中總生物堿提取工藝,建立大麥芽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法,為其生物堿部位進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。方法 采用超聲法提取麥芽總生物堿,用高效液相色譜法測定大麥芽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)；并以麥芽總生物堿和大麥芽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗,優(yōu)選出麥芽生物堿物質(zhì)的最佳提取工藝。結(jié)果 總生物堿的最佳提取方法為:用5倍量的體積分?jǐn)?shù)80%甲醇,超聲提取3次,每次45 min。不同產(chǎn)地的麥芽中生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異很大,其中安徽亳州產(chǎn)的生麥芽中生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對較高。結(jié)論 建立的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法準(zhǔn)確穩(wěn)定、重復(fù)性好,優(yōu)選的提取工藝合理。不同產(chǎn)地麥芽生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大,需要制定規(guī)范的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

生麥芽； 總生物堿； 大麥芽堿； 不同產(chǎn)地

麥芽為禾本科植物大麥(HordeumvulgareL.)的成熟果實(shí)經(jīng)發(fā)芽干燥的炮制加工品[1]。麥芽有生麥芽、炒麥芽、焦麥芽之分。由于服用劑量大小的差異,麥芽具有回乳和催乳的雙向作用[2]。據(jù)文獻(xiàn)[3-4]報道,麥芽提取物具有治療高泌乳素血癥的作用,推測麥芽中可能含有與溴隱亭結(jié)構(gòu)相似的生物堿類物質(zhì),但并無試驗證據(jù)[5-6]。為此,本課題組在前期試驗圍繞麥芽回乳作用與生物堿物質(zhì)進(jìn)行了研究,初步明確了生麥芽生物堿粗提物就是其回乳作用的有效部位[7],并建立了麥芽中總生物堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法[8]。

本文主要針對麥芽生物堿物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行考察,建立生麥芽中大麥芽堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法,并且比較不同產(chǎn)地麥芽中生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異,為完善麥芽藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及后期的生物堿純化提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Dionex UltiMate 3000型系列高效液相色譜儀(美國Dionex公司)；pHS-3C(上海今邁儀器儀表有限公司)； Master-SUF超純水機(jī)(上海和泰儀器有限公司)；BT25S型十萬分之一分析天平(Sartorius中國公司)；KQ-300E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

生大麥、生麥芽及炒麥芽樣品(見表1)經(jīng)武漢市第三醫(yī)院藥學(xué)部陳永剛副主任中藥師鑒定,均為禾本科植物HordeumvulgareL．的成熟果實(shí)經(jīng)發(fā)芽干燥的炮制加工品。大麥芽堿對照品(批號：30845,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%,阿拉丁)；甲醇為色譜純,其余試劑均為分析純,水為超純水。

表1 不同產(chǎn)地麥芽的信息Table 1 The information of different regions of malt

2 方法與結(jié)果

2.1 不同溶劑提取麥芽總生物堿[9-10]

精密稱取麥芽粗粉(批號：20151201)10 g,置于具塞錐形瓶中,加入不同濃度的不同溶劑100 mL,超聲提取1 h,濾過,濾液置水浴鍋上揮干,殘渣用pH=2～3的HCl溶液溶解并定容至10 mL,采用酸性染料比色法[8]測定總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果見表2。

表2 不同溶劑提取麥芽生物堿的結(jié)果Table 2 The results of different solvents extraction

根據(jù)提取結(jié)果綜合考慮麥芽中總生物堿和大麥芽堿的提取效果,最終選擇甲醇作為麥芽生物堿的提取溶劑,以優(yōu)選麥芽生物堿的最佳提取工藝。

2.2 大麥芽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定[11-12]

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Phenomenex luna C8柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流動相為甲醇-0.05 moL/L KH2PO4(三乙胺調(diào)pH=7.10)溶液(體積比5∶95)等度洗脫,流速：1 mL/min,柱溫：25 ℃,檢測波長：226 nm,進(jìn)樣量：20 μL。色譜圖見圖1。

2.2.2 對照品溶液的配制 精密稱取大麥芽堿3.75 mg,用pH=2～3的HCl溶液溶解并定容至25 mL,配制成質(zhì)量濃度為150 μg/mL的對照品溶液。2.2.3 樣品溶液的配制 精密稱取麥芽粗粉(批號：20151201)10 g,置于具塞錐形瓶中,加入體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液50 mL,超聲提取1 h,濾過,濾液置水浴鍋上揮干,殘渣用pH=2～3的HCl溶液溶解后定容至10 mL。

圖1 大麥芽堿對照品(A)、生麥芽樣品(B)和炒麥芽樣品(C)的高效液相色譜圖

Figure 1 HPLC chromatograms of hordenine control (A),raw malt (B),and fried malt (C)

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取“2.2.2”項下配制的大麥芽堿對照品溶液0.5、1、2、4、5、10 mL置于10 mL容量瓶中,用pH=2～3的HCl溶液稀釋定容至刻度。按照“2.2.1”項下色譜條件測定大麥芽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù),以大麥芽堿質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)和相應(yīng)峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程Y=0.401 1X-1.063 5(r=0.999 7),表明大麥芽堿質(zhì)量濃度在7.5～150 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下配制的大麥芽堿對照品溶液適量,連續(xù)進(jìn)樣6次,按照“2.2.1”項下色譜條件測定大麥芽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù),記錄峰面積,RSD為0.31%,表明儀器精密度較好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.2.3”項下樣品溶液,分別于0、6、12、18、24 h進(jìn)樣,記錄大麥芽堿峰面積,結(jié)果峰面積的RSD為3.56%,表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗 精密稱取麥芽粗粉10 g(批號：20151201),平行6份,按照“2.2.3”項下樣品溶液配制方法進(jìn)行制備,進(jìn)樣檢測記錄峰面積,RSD為1.19%(n=6),表明方法具有較好的重復(fù)性。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)同一批次的麥芽粗粉(批號：20151201)9份置于具塞錐形瓶中,加入“2.2.2”項下配制的大麥芽堿對照品0.15、0.20、0.22 mg,按照“2.2.3”項下樣品溶液配制方法進(jìn)行制備,進(jìn)樣檢測記錄峰面積,平均加樣回收率為98.66%,RSD為2.18%(n=9)。

2.3 優(yōu)選麥芽生物堿最佳提取工藝

2.3.1 正交試驗 根據(jù)以上試驗結(jié)果,以甲醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、甲醇用量、提取次數(shù)為考察因素,以總生物堿和大麥芽堿提取量的綜合評分[13](綜合評分=總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)/總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大值×60+大麥芽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)/大麥芽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大值×40)為評價指標(biāo),稱取生麥芽粗粉9份,每份10 g,按L9(34)正交表進(jìn)行試驗設(shè)計,因素水平安排及結(jié)果見表3～表5。

表3 正交試驗因素和水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal test

由直觀分析可知,影響生物堿提取率的因素大小順序為A>D>C>B,即甲醇體積分?jǐn)?shù)>提取次數(shù)>甲醇用量>提取時間。方差分析結(jié)果表明因素A對生物堿提取量的影響具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其他因素的影響則無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。確定麥芽生物堿的最佳提取工藝條件為A2B2C1D3,即80%甲醇5倍量,超聲提取3次,每次45 min。

2.3.2 驗證試驗 稱取麥芽粗粉(批號：20151201)3份,每份10 g,按優(yōu)選的提取工藝條件進(jìn)行提取。結(jié)果顯示總生物堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為224.2 μg/g,大麥芽堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為71.83 μg/g,比正交試驗中每組試驗結(jié)果都要好,且RSD分別為1.20%和2.22%,表明優(yōu)選的最佳提取工藝準(zhǔn)確可靠。

2.4 不同產(chǎn)地不同批次樣品中生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

取不同產(chǎn)地不同批次的生麥芽和生大麥樣品,按“2.3”項優(yōu)選出的生物堿提取工藝制備樣品溶液,分別測定樣品中生物堿物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果見表6。

表4 麥芽生物堿提取工藝正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal test results of extraction technology

表5 正交試驗結(jié)果方差分析Table 5 Orthogonal test results and variance analysis

表6 不同產(chǎn)地不同批次麥芽樣品中生物堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

Table 6 The alkaloid content of different batch samples from different regions (n=3)

批號w(大麥芽堿)/(μg·g-1)w(總生物堿)/(μg·g-1)2013091182.26188.0020131026125.77199.9320131225135.04206.802015120184.87220.122012080139.65115.092013072957.8096.75201308250127.01201309060154.07201503250237.982012071545.1681.622013101174.6198.122013111065.6992.172014022270.1599.50

可見,不同產(chǎn)地生麥芽中生物堿成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差較大,安徽亳州產(chǎn)的生麥芽中生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。同一產(chǎn)地同一炮制規(guī)格的藥材中生物堿成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)也有較大差別；生大麥在發(fā)芽后,總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大，經(jīng)過炒制后,總生物堿與大麥芽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有所降低。

3 討論

麥芽中的生物堿類物質(zhì)主要有大麥芽堿、大麥芽新堿A和大麥芽新堿B等,它們的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是氮原子不在環(huán)狀結(jié)構(gòu)內(nèi),屬于有機(jī)胺類生物堿,易溶于有機(jī)溶劑[8]。不同溶劑提取試驗結(jié)果顯示,含醇溶劑生物堿提取量比酸水高,可能與其生物堿的這一理化性質(zhì)有關(guān)。

不同產(chǎn)地麥芽樣品生物堿物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大,可能跟地域環(huán)境有關(guān)。不同規(guī)格麥芽樣品生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果表明,生大麥中不含大麥芽堿,說明大麥芽堿是麥芽在發(fā)芽過程中產(chǎn)生的次生代謝物。生麥芽比炒麥芽中總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)高,可能是由于麥芽在炒制過程中溫度等因素破壞了生物堿成分,降低了總生物堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。針對這一點(diǎn),對提取過程中水浴揮干溶劑的溫度進(jìn)行了考察,發(fā)現(xiàn)溫度確實(shí)對生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)有影響,所以在試驗過程中需要注意控制溫度。因此,若以炒麥芽入藥回乳則需加大劑量。

本文研究表明,優(yōu)化工藝可保證生物堿物質(zhì)被充分提取出來。不同產(chǎn)地、不同規(guī)格麥芽的生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大,亟需制定以藥效物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為指標(biāo)的麥芽藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)加以規(guī)范。

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(責(zé)任編輯：陳翔)

Optimization of extraction process of alkaloids from malt and comparison of different regions

LI Lijiao1,CHEN Yonggang2,ZHANG Keda2,CHEN Min2,HE Jing1

(1.SchoolofPharmacy,HubeiUniversityofChineseMedcine,Wuhan430065,China; 2.DepartmentofPharmacy,theThirdHospitalofWuhan,Wuhan430060,China)

Objective To optimize the extraction technology of the total alkaloids and determine the hordenine in malt to lay the foundation for further study of total alkaloids. Method The ultrasonic extraction was used to extract total alkaloids and the high performance liquid chromatography was used to determine hordenine. The extraction of total alkaloids and hordenine as indicators,the orthogonal test was used to optimize the best extraction method of alkaloids in malt. Results The best extraction method of total alkaloids was as follows: five times the amount of 80% methanol,ultrasonic extract 3 times with 45 minutes each time. The content of total alkaloids in the malt of different regions was different,and it was especially high in the raw malt of Bozhou in Anhui. Conclusion The content determination method is accurate,stable,good repeatability and the optimization of extraction technology is reasonable. The content of alkaloids in the different regions is different,so the malt needs to be set the quality control standard.

raw malt; total alkaloid; hordenine; different regions

2016-06-17

湖北省自然科學(xué)基金項目(2014CFC1044,2014CFC1045)；武漢市衛(wèi)生計生委項目(WZ12B05,WX15A02)

李麗姣(1991—),女,2014級碩士研究生,Email:1427735720@qq.com；通信作者：陳永剛(1975—),男,博士,副主任中藥師,從事中藥資源開發(fā)利用與新藥研究,Email:cyg508@163.com。

時間：2016-09-28 16:02

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160928.1602.002.html

R284.2

A

1006-8783(2016)05-0572-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016061707