摘 要 為了探究半夏連作障礙的機理，以貴州貴陽花溪半夏大田種植的連作（非）根際土壤、正茬（非）根際土壤和沒有栽植過半夏的土壤為樣本。試驗通過涂布平板法培養(yǎng)微生物，用活菌計數(shù)法統(tǒng)計各土壤樣本中的微生物數(shù)量。純化分離微生物后觀察其形態(tài)特征和對細菌進行革蘭氏染色鑒定。試驗得出結(jié)果：半夏連作會引起土壤微生物的數(shù)量和種類的顯著變化。連作根際土壤中的微生物總數(shù)降低、非根際土壤中微生物總數(shù)增加，土壤有由細菌型土壤向真菌性土壤轉(zhuǎn)變的趨勢。連作之后，土壤微生物種類發(fā)生了變化，根際土壤中多樣性增加，非根際土壤中多樣性降低，這不利于土壤微生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定，并且連作土壤肥力下降，可能是連作半夏病害加重、品質(zhì)下降、產(chǎn)量降低的重要原因。

關(guān)鍵詞 半夏；連作障礙；土壤微生物；活菌計數(shù)法；革蘭氏染色

中圖分類號：S567.23+9；S182 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.19.033

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半夏（Pinellia ternata Briet.）是天南星科半夏屬多年生草本植物，是我國著名的中藥材之一。被廣泛應(yīng)用于各種中藥處方中。半夏以塊莖入藥，具有燥濕化痰、降逆止嘔、清痞散結(jié)等功效，近年來，又發(fā)現(xiàn)半夏具有抗腫瘤、抗生育、降血脂、護肝和治療冠心病等多種重要的作用[1]。目前，半夏藥材主要來源于人工種植[2]。但是半夏在連作種植后會出現(xiàn)病害加重、產(chǎn)量逐年降低、品質(zhì)逐年下降的現(xiàn)象[3]，即連作障礙[4]。日本學(xué)家瀧島[5]將引起連作障礙的原因歸納為五個方面：土壤養(yǎng)分失衡、土壤有害生物積聚、土壤理化性狀惡化、植物對土壤有害物質(zhì)的積累、土壤微生物區(qū)系劣變。近年來針對半夏連作障礙機理的研究很少，對于半夏的研究大多集中在半夏病蟲害、人工栽培措施等方面。

貴州是半夏藥材主產(chǎn)區(qū)[6]，由于連作障礙嚴重，加上山區(qū)土地有限，無法實行輪作等，致使種植半夏效益不穩(wěn)定，藥農(nóng)積極性不高，不利于當(dāng)?shù)亟?jīng)濟的發(fā)展。因此，探明半夏連作障礙的機理，找出緩解和解決半夏連作障礙的措施迫在眉睫。本試驗針對半夏連作與土壤中的微生物變化關(guān)系展開研究，為揭示半夏連作障礙的機理進行初步探究。

1材料與方法

1.1土壤

采自貴陽市花溪區(qū)半夏大田種植基地（E 106°40′677″、N 26°25′658″，海拔1171 m）的半夏正茬（非）根際土壤、重茬（非）根際土壤，以未種植半夏的土壤為對照土壤。

1.2培養(yǎng)基

培養(yǎng)真菌用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水1000 mL、pH為7.2～7.4（添加青霉素或鏈霉素抑制細菌和放線菌的生長）。

培養(yǎng)放線菌用高氏一號培養(yǎng)基：NaOH 20 g、KNO3 1 g、K2HPO3·2H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂20.0 g、水1000 mL、pH為7.4～7.6（添加重鉻酸鉀抑制劑，防止細菌的干擾）。

培養(yǎng)細菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g、蛋白胨5 g、氯化鈉10 g、瓊脂20.0 g、pH 7.0～7.2、水1000 mL。

1.3試驗器材和試劑

1.3.1 儀器

DHG-9145A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海和呈儀器有限公司）、LDZM-40KCS高壓蒸汽滅菌鍋（上海茸研儀器有限公司）、SHZ-型水浴恒溫振蕩器（上虞艾科儀器有限公司）、JB-CJ-1500/1500U超凈工作臺（蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司）、LHS-150SC恒溫恒濕箱（上海天呈儀器制造有限公司）、100 μL移液槍、XSP-36生物顯微鏡（盛天儀器有限公司）等。

1.3.2 試劑

75%乙醇、95%乙醇、1 mol/L鹽酸、1 mol/L氫氧化鈉、結(jié)晶紫染色液、碘液、番紅染色劑、香柏油等。

1.4試驗方法

1.4.1 土樣的采集和處理

采用五點法取樣，先用取樣鏟將表層5 cm左右的表土除去，取5～15 cm處的土樣1 kg，混勻后，四分法留樣500 g，裝入密封袋，帶回實驗室后將新鮮土樣研磨過2 mm篩，存放在4℃以下的冰箱內(nèi)備用。

取10 g研磨后的土樣加入90 mL無菌水，震蕩搖勻后配制成土壤懸浮液，作為母液，之后按照10倍梯度稀釋法將母液分別配制成稀釋100倍液、稀釋1000倍液、稀釋10000倍液。

1.4.2 微生物的接種與培養(yǎng)

取100 μL菌液均勻涂布在9 cm平板上，在37℃下培養(yǎng)細菌36 h；在28℃下培養(yǎng)放線菌5 d；在28℃下培養(yǎng)真菌7 d[7]。每天觀察生長情況、計數(shù)，重復(fù)3次。

1.4.3 微生物的分離純化及初步鑒定

分離純化：將形態(tài)特征不同的菌落分別進行單獨培養(yǎng)，進一步純化。純化后細菌進行革蘭氏染色試驗，在油鏡下觀察染色結(jié)果，革蘭氏陰性菌染色呈紅色，革蘭氏陽性菌染色呈藍紫色。

1.5數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

微生物計數(shù)采用平板計數(shù)法（CFU法）[8-10]，公式：

每克土壤中的活菌數(shù)（cfu/g）=同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)。

根土比計算公式[11]：R/S=根際土壤中的微生物數(shù)量/非根際土壤中的微生物數(shù)量

土壤微生物菌群多樣性香農(nóng)-威納指數(shù)[12]（H）的計算公式：

土壤微生物菌群的均勻度E的計算公式：E=H/lnS

其中Pi=Ni/N指某群落中第i個類型的個體數(shù)占總個體數(shù)的百分比，S為微生物類群數(shù)量。

細菌和真菌數(shù)量的比值B/F的計算公式：B/F=土壤中細菌數(shù)量/土壤中真菌數(shù)量

2結(jié)果與分析

2.1半夏連作對土壤微生物數(shù)量的影響

從表1可以得知，隨著半夏種植模式的增加，土壤中微生物的數(shù)量發(fā)生了很大的改變，微生物總數(shù)由大到?。褐夭绶歉H土壤>正茬非根際土壤>對照土壤；正茬根際土壤>重茬根際土壤>對照土壤；重茬土壤>正茬土壤>對照土壤。因此，隨著半夏連作的進行，連作土壤的微生物總數(shù)呈上升趨勢；連作根際土壤的微生物總數(shù)呈下降趨勢；連作非根際土壤的微生物總數(shù)呈上升趨勢。并且在所有土樣中均是細菌總數(shù)最多，放線菌其次，真菌總數(shù)最少。

半夏正茬土壤中細菌根土比是重茬土壤中的細菌根土比的39.21倍，說明半夏連作使細菌的根土比顯著降低。同時，重茬根際土壤中的細菌數(shù)量是正茬根際土壤中細菌數(shù)量的18%，重茬非根際土壤中的細菌數(shù)量是正茬非根際土壤細菌數(shù)量的7.07倍，也表明半夏連作導(dǎo)致根際土壤的細菌數(shù)量減少（比對照土壤細菌數(shù)量要少），非根際土壤的細菌數(shù)量增加，連作之后，根際土壤中的細菌有向非根際土壤中遷移的趨勢。

半夏正茬土壤中放線菌的根土比是重茬土壤中的放線菌根土比的1.05倍，說明半夏連作對放線菌根土比的影響不大。另一方面，重茬根際土壤中的放線菌數(shù)量是正茬根際土壤中細菌數(shù)量的1.09倍，重茬非根際土壤中的放線菌數(shù)量是正茬非根際土壤細菌數(shù)量的1.14倍，也進一步證明半夏連作對放線菌根際土和非根際的數(shù)量變化不大。

半夏正茬土壤中真菌根土比是重茬土壤中的真菌根土比的79.03倍，說明半夏連作使真菌的根土比顯著降低。并且重茬根際土壤中的真菌數(shù)量是正茬根際土壤中真菌數(shù)量的27%，重茬非根際土壤中的真菌數(shù)量是正茬非根際土壤真菌數(shù)量的21.35倍，也說明半夏連作導(dǎo)致根際土壤的真菌數(shù)量減少（比對照土壤真菌數(shù)量要多），非根際土壤的真菌數(shù)量增加。

同時，我們還可以得知，重茬根際土壤中，真菌減少的速度要小于細菌減少的速度，并且重茬根際土中真菌的數(shù)量要大于對照土壤中真菌的數(shù)量，細菌的數(shù)量比對照土壤中細菌的數(shù)量要少。因此，在重茬根際土壤中真菌處于優(yōu)勢種群。種植半夏有使土壤由細菌型土壤向真菌型土壤轉(zhuǎn)變的趨勢。

2.2半夏連作對土壤微生物多樣性和均勻度的影響

土壤微生物菌群多樣性的香農(nóng)-威納指數(shù)可以反應(yīng)某個土壤區(qū)域內(nèi)微生物菌群的豐富度，而均勻度指數(shù)則可以反應(yīng)某個土壤區(qū)域內(nèi)微生物菌群分布的比例和均勻程度。從表2可以看出，多樣性指數(shù)從大到小分別是重茬根際土壤>對照土壤>重茬非根際土壤；正茬根際>正茬非根際>對照土壤，均勻度指數(shù)的變化趨勢與多樣性指數(shù)一致。說明根際土壤的生物多樣性與均勻度總是要大于非根際土壤。這也與陸雅海等[13]關(guān)于根際微生物的種類要比非根際豐富的論斷一致。

連作之后，重茬根際土壤中微生物的多樣性和均勻度比正茬根際中微生物的多樣性和均勻度要大，原因在于重茬土壤中不僅半夏根系分泌物增多，而且還有大量半夏殘茬，它們共同造成了有害微生物大量積累和滋生，這可能也是連作半夏病害嚴重，感病植株增多的原因之一。重茬非根際土壤中微生物的多樣性和均勻度要比正茬非根際土壤的多樣性和小，并且還要小于對照土壤的多樣性和均勻度，說明連作之后，非根際土中微生物種類趨于單一，土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性下降。

2.3半夏連作對土壤肥力的影響

細菌和真菌數(shù)量比值B/F可以作為土壤肥力的一個指標，有研究認為，一般細菌密度高的土壤，肥力也較強。本研究發(fā)現(xiàn)，B/F由大到小為：正茬非根際（136.50）>重茬非根際（45.21）>對照土壤（41.17）>正茬根際（4.23）>重茬根際（2.82）。

B/F值正茬根際土壤大于重茬根際土壤，正茬非根際土壤大于重茬非根際土壤，說明在連作之后，細菌密度降低、土壤肥力降低，這可能是導(dǎo)致半夏產(chǎn)量下降的又一原因。

2.4不同種植模式半夏土壤中細菌的初步分離與鑒定

分離純化后細菌的革蘭氏染色結(jié)果見表3、表4。與正茬根際土壤相比，重茬根際土壤中短棒狀、長線狀的革蘭氏陰性菌和長線狀的革蘭氏陽性菌減少了；而長棒狀的革蘭氏陰性菌增加了；其他的則在正茬的基礎(chǔ)上有所減少。與正茬非根際土壤相比，重茬非根際土壤中圓球狀革蘭氏陰性菌、短棒狀和短桿狀的革蘭氏陽性菌減少了，短棒狀的革蘭氏陰性菌增加了。

如圖1所示，重茬根際土壤中的細菌菌斑呈圓形，稍凸起，光滑，顏色灰白略帶黃色。黃旭等[14]的研究從半夏軟腐病的病原中分離出了幾種致病細菌，分別屬于腸桿菌科克雷伯氏桿菌屬、胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種，這幾種致病菌均為革蘭氏陰性菌，呈短桿狀，在LB培養(yǎng)基上的生長情況也與本研究結(jié)果一致。何煜波等[15]的研究也證明了這一點。因此，要證明引起本研究試驗地半夏連作障礙病害的細菌病原體可能是克雷伯氏桿菌屬和胡蘿卜軟腐果膠桿菌，這需要進一步研究。

2.5不同種植模式半夏土壤中真菌的初步分離與鑒定

本研究發(fā)現(xiàn)，來自重茬土壤的經(jīng)過分離純化的真菌菌落，基本上存在4種長勢：（1）全部都是白色絮狀；（2）菌絲為白色，但菌落底部中心呈黃色；（3）菌絲為白色，但菌落底部呈灰黑色；（4）菌絲為白色，菌落底部中心呈青色。曾令祥等[16]的研究結(jié)論是：半夏常見病害中有3種是由真菌引起的。半夏種球腐爛病病原菌為鐮刀菌屬的一種真菌；莖腐病病原菌多為鐮刀菌屬侵染引起，少數(shù)由疫霉屬侵染引起；灰霉病為葡萄孢屬的真菌侵染引起。孫新榮等[17]研究半夏塊莖腐爛病的病原真菌，觀察到病原真菌的生長特征為菌落突起絮狀，菌絲白色致密，菌落高3～5 mm，菌落底部中心部位呈牽牛紫色，最后通過觀察大型孢子和小型孢子的形態(tài)特征，并進行孢子大小等顯微計測等，得出引起半夏塊莖腐爛病的病原真菌是鐮刀屬的尖孢鐮刀菌。石建龍等[18]同樣分析得出結(jié)論：引起半夏塊莖腐爛病的病原真菌是茄病鐮刀菌和尖孢鐮刀菌。肖艷紅等[19]的研究認為藥用植物土壤根際的真菌優(yōu)勢種有青霉屬、木霉屬、曲霉屬、鐮刀菌屬等。因此，要證明引起本研究試驗地半夏連作障礙病害的致病真菌是何種真菌，還需要進一步進行生理生化和DNA鑒定。

3小結(jié)與討論

本研究得出結(jié)論：半夏連作會引起土壤微生物的顯著變化。（1）半夏連作會使土壤中微生物總量呈增加趨勢，且主要是非根際土的微生物總量呈增加，而根際土壤微生物總量則呈降低趨勢。（2）半夏連作后，真菌成為土壤優(yōu)勢種群，即土壤有由細菌型土壤向真菌型土壤轉(zhuǎn)變的趨勢。一般認為真菌型土壤是地力衰竭的標志。（3）半夏連作根際土壤的B/F值低于正茬土壤的B/F值，即種植半夏會使土壤肥力降低。因此，要想解決或緩解半夏連作障礙問題，首要措施是阻止或延緩?fù)寥老蛘婢屯寥擂D(zhuǎn)變。

半夏連作根際土壤中多樣性增加，連作非根際土壤中多樣性降低，說明土壤微生物群落或種類發(fā)生了變化，這不利于土壤微生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定，可能是連作半夏病害加重、品質(zhì)下降、產(chǎn)量降低的重要原因。針對這種情況，有研究發(fā)現(xiàn)，可以通過引入對有害微生物起作用的拮抗細菌和有益微生物[20]來減少半夏連作病害的發(fā)生和提高土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

從半夏連作根際土壤中純化分離出來3種革蘭氏陰性菌、3種革蘭氏陽性菌、4種真菌。根據(jù)研究，細菌極有可能屬于克雷伯氏桿菌屬和胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種，真菌極有可能屬于鐮刀菌屬、木霉屬、青霉屬、曲霉屬等。具體的屬種還需要進一步進行生理生化或者DNA鑒定。

連作障礙是“土壤—微生物—植物—氣候”綜合作用的結(jié)果，單一因素的研究很難對田間情況作出較合理的解釋[21]。因此，要想探究連作障礙的發(fā)生機制，還必須要把諸多因素綜合起來分析，本研究只是從微生物角度做了初步探索，半夏連作障礙的發(fā)生機制還有待進一步研究。

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（責(zé)任編輯：丁志祥）