摘 要 以實際應(yīng)用價值較高的大田成齡去頂番木瓜側(cè)芽為外植體，對采摘的外植體及時進行預(yù)處理及不同組合處理，與常規(guī)外植體消毒方法作對比試驗。結(jié)果表明，“采摘時預(yù)處理+不同組合處理+常規(guī)消毒方法”的多重消毒模式，有利于增加番木瓜外植體的成活率，其中以“外植體采摘去葉后用300 mg/L青霉素鈉浸泡→飽和肥皂水洗凈→500 mg/L青霉素鈉浸泡3 h→75%酒精浸泡30 s→無菌水沖洗2次→0.1%升汞消毒10 min→無菌水沖洗3次”的滅菌效果最好，外植體成活率達(dá)到57.78%。

關(guān)鍵詞 番木瓜；外植體；預(yù)處理；青霉素鈉；多重消毒模式；消毒效果

中圖分類號：S667.9；S603.8 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-890X（2016）10-060-03

知網(wǎng)出版網(wǎng)址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.s.20160422.1545.048.html 網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-4-22 15：45：20

番木瓜（Carica papaya L.）是番木瓜科番木瓜屬植物，也稱木瓜、萬壽果，原產(chǎn)于墨西哥南部和美洲地區(qū)，目前在我國熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛種植[1]。因其營養(yǎng)豐富，肉質(zhì)細(xì)滑，柔軟香甜，爽口多汁，還具有一定保健作用，是深受人們喜愛的熱帶水果之一，故其食用價值、經(jīng)濟價值也越來越受到人們的重視，是有廣闊發(fā)展前景的熱帶特色果樹[2]。由于番木瓜種性復(fù)雜，屬于特殊的雌雄異株果樹，同時存在雌株、雄株和兩性株3種株型，常規(guī)的種子繁殖難以保證植株株性一致；采用扦插、嫁接等無性繁殖技術(shù)的成活率又低，達(dá)不到工廠化、規(guī)?；挠缫骩1， 3]。通過選擇優(yōu)良植株的莖尖、側(cè)芽為外植體來進行組織培養(yǎng)，可獲得大量同質(zhì)的種苗，是解決以上難題的有效途徑[1， 4]，但是番木瓜外植體初次接種污染率高、成活率低的問題成為制約番木瓜快速繁殖發(fā)展的一大瓶頸。

生長健壯、株型、果型、品質(zhì)、抗性等性狀優(yōu)良的田間成齡番木瓜植株，雖然具有很高的實際應(yīng)用價值，但生長環(huán)境相對復(fù)雜，植株表面帶菌量多且雜，自身又含有乳白汁液，只對其進行常規(guī)外植體消毒很難得到成活率高的無菌體。本研究以性狀優(yōu)良的大田成齡番木瓜側(cè)芽為外植體，外植體采摘時就進行預(yù)處理，在常規(guī)消毒的基礎(chǔ)上，針對番木瓜成齡側(cè)芽帶菌多又組織幼嫩不可過度滅菌的特點，選擇對幼嫩組織傷害較輕的試劑進行多重消毒滅菌，找出有效降低污染率的方法，為番木瓜組培快繁及工廠化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)和提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1試驗材料

以云南省紅河熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院水果研究中心大田種植，性狀優(yōu)良的番木瓜品種‘蘇羅’成齡去頂側(cè)芽為外植體，一般采摘莖段直徑0.3～0.6 cm的側(cè)芽。試驗中用到的消毒滅菌試劑有：青霉素鈉消毒溶液，由哈藥集團制藥總廠生產(chǎn)的青霉素鈉和無菌水配制而成；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液，由中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn)的聚乙烯吡咯烷酮（K30）和無菌水配制而成；1%NaClO溶液，由貝康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的3%次氯酸鈉注入純水稀釋而成；0.1%高錳酸鉀溶液，由上海興塔化工廠生產(chǎn)的分析純高錳酸鉀和無菌水配制而成；多菌靈溶液，由國光農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)的多菌靈可濕性粉劑與無菌水按比例稀釋而成；75%酒精溶液；0.1%升汞溶液。

1.2試驗方法

1.2.1 采摘時預(yù)處理

將采摘下的番木瓜側(cè)芽去葉后立即作如下處理：浸入300 mg/L青霉素鈉溶液中；用70%酒精棉球涂抹表面和切面后侵入無菌水中；放入干凈密封容器中。在進行以上預(yù)處理后，用無菌水沖洗干凈，進行常規(guī)消毒，消毒方法為：75%酒精浸泡30 s→無菌水沖洗2次→0.1%升汞浸泡10 min→無菌水沖洗3次。然后接種到初步培養(yǎng)基上。以上每個處理接種外植體15個，重復(fù)3次，15 d后統(tǒng)計污染率。

1.2.2 多重消毒模式

將采摘時經(jīng)過300 mg/L青霉素鈉浸泡處理的番木瓜側(cè)芽，沖洗干凈，再放入飽和肥皂水中洗滌，并用無菌水沖洗，然后用不同試劑處理+常規(guī)消毒方法進行外植體消毒對比試驗。不同組合處理方式見表1，常規(guī)消毒方法同上，每個處理接種外植體30個，重復(fù)3次，接入初步培養(yǎng)基上，初步培養(yǎng)基為“MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+5 g/L卡拉膠+30 g/L蔗糖”，pH=5.8。外植體接種后，先暗培養(yǎng)7 d后，置于日光燈下，光照強度為1500 lx，每天光照10～12 h，培養(yǎng)溫度（30±2）℃。

1.2.3 統(tǒng)計分析方法

外植體接種15 d后統(tǒng)計污染率、死亡率、成活率。

污染率（%）=污染外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100

死亡率（%）=死亡外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100

成活率（%）=成活外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100

試驗數(shù)據(jù)用SPSS19.0 for windows中的ANOVA進行統(tǒng)計分析，用LSD進行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1采摘時預(yù)處理對外植體的消毒效果

試驗結(jié)果表明，“采摘時預(yù)處理+常規(guī)消毒”對番木瓜外植體消毒有一定降低污染率的作用，與“無菌水+常規(guī)消毒”（CK）比較消毒效果顯著，其中以300 mg/L青霉素鈉溶液浸泡較好，70%酒精棉球涂抹次之（見表2）。由于大田番木瓜露天栽培，生長環(huán)境復(fù)雜，含菌量多且雜，番木瓜側(cè)芽表皮較薄，植物組織幼嫩，內(nèi)含有白色乳汁，因此給外植體的消毒滅菌增加了難度。筆者在試驗生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)，取側(cè)芽的番木瓜大田到組培室往往有很長的距離，采摘側(cè)芽到進行外植體消毒也要經(jīng)過一段時間，根據(jù)番木瓜側(cè)芽的特性，采摘時就進行預(yù)處理，減少二次污染的概率，提高外植體的成活率是很有必要的。

2.2多重消毒模式對外植體消毒效果的影響

從圖1可見，多重消毒模式比常規(guī)消毒模式污染率明顯降低，效果顯著，其中Y2處理對番木瓜大田成齡側(cè)芽效果最好，污染率最低（35.56%），死亡率較低（6.67%），成活率最高（57.78%）。Y1處理對番木瓜大田成齡側(cè)芽效果次之，成活率42.22%，污染率52.22%，與對照組的污染率、死亡率、成活率相比較也有很好的消毒滅菌效果，和周鵬等研究報道一致[1]。試驗也首次嘗試?yán)梅腔瘜W(xué)試劑進行消毒滅菌，選擇無殘留、無污染的臭氧（Y6處理）進行外植體表面滅菌，效果雖比對照組（CK）稍好，但污染率還是較高，不能達(dá)到初次接種的無菌要求。表明消毒效果較好，成活率較高，較實用的消毒方式為Y2組合處理（500 mg/L青霉素鈉溶液浸泡3 h+常規(guī)消毒方法）。

3小結(jié)與討論

利用成齡番木瓜側(cè)芽作為外植體材料進行離體培養(yǎng)快速繁殖較具實際應(yīng)用價值，但田間采摘成年番木瓜側(cè)芽的外植體材料攜帶大量微生物，如何消毒滅菌，獲得無菌外植體，是組培生產(chǎn)中首先要解決的問題。吳坤林等[5]采用合適的消毒劑和消毒程序建立高效無菌外植體技術(shù)體系，大幅度提高了消毒滅菌成功率；王龍甫等[6]用ClO2和消佳凈為番木瓜外植體消毒新組合試劑也取得一定的效果；王麗萍等[7] 用熱水浸泡外植體，再用“75%酒精+15%次氯酸鈉5 min+0.1%升汞17 min”消毒劑組合對外植體消毒效果也好。但筆者在實際試驗中發(fā)現(xiàn)，番木瓜側(cè)芽在0.1%升汞溶液中浸泡時間超過14 min時外植體死亡率就開始急劇增加，建議在實際生產(chǎn)中適當(dāng)縮短升汞消毒的時間。

對番木瓜成齡側(cè)芽外植體要取得較理想的消毒效果，不但表面消毒滅菌要干凈徹底，抑制內(nèi)生菌的生長也是關(guān)鍵，本試驗預(yù)處理使用青霉素鈉溶液浸泡對內(nèi)生菌的抑制有一定的效果，通過試驗得到如下的多重消毒模式：外植體采摘后及時用300 mg/L青霉素鈉浸泡→飽和肥皂水洗凈→500 mg/L青霉素鈉溶液浸泡3 h+75%酒精浸泡30 s→無菌水沖洗2次→0.1%升汞浸泡10 min→無菌水沖洗3次，然后接種到初步培養(yǎng)基上。這種多重消毒模式效果較好，外植體成活率達(dá)到55%以上，大大提高了獲得無菌外植體的成功率。

參考文獻：

[1]周鵬，沈文濤.番木瓜生物技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011.

[2]陳健.番木瓜品種與栽培彩色圖說[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

[3]Litz R E，Conover R A. Effect of sex type，season and other factors on in vitro establishment and culture of Carica papaya L.explants [J].Journal of the American Society of Horticultural Science，1981，106（6）：792-794.

[4]Larkin P J，Scowcroft W R. Some clonal variation anoval source of variability from cell culture for plant improvement [J].Theory and Applied Genet， 1981（60）：197-214.

[5]吳坤林，曾宋君，張志勝，等.番木瓜外植體消毒方法研究[J].福建林業(yè)科技，2008，35（3）：76-79.

[6]王龍甫，陳彪，梁鉀賢，等.大田番木瓜外植體消毒滅菌方法探討[J].中國南方果樹，2010，39（2）：42-44.

[7]王麗萍，鄧澤周，葉祖烈，等.成齡番木瓜組培快繁技術(shù)研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（3）：43-45.

（責(zé)任編輯：丁志祥）