史珣貝吳南郭維維楊仕明林昶福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科,福建省耳鼻咽喉研究所(福州350005)解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,解放軍耳鼻咽喉研究所,聾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京00853)
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腺相關(guān)病毒在耳聾基因治療上的應(yīng)用
史珣貝1吳南2郭維維2楊仕明2林昶1
1福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科,福建省耳鼻咽喉研究所(福州350005)
2解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,解放軍耳鼻咽喉研究所,聾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京100853)
【摘要】由于腺相關(guān)病毒具有獨(dú)特的載體優(yōu)勢,越來越多地被應(yīng)用在基因治療中。大量文獻(xiàn)表明,腺相關(guān)病毒可以攜帶目的基因通過不同手術(shù)途徑成功導(dǎo)入遺傳性耳聾動物模型,在毛細(xì)胞,血管紋,支持細(xì)胞,螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等成功表達(dá),實(shí)現(xiàn)形態(tài)學(xué)和功能學(xué)的恢復(fù)。本文總結(jié)應(yīng)用腺相關(guān)病毒進(jìn)行耳聾基因治療的研究進(jìn)展,突出其優(yōu)勢,總結(jié)成功經(jīng)驗(yàn)及存在問題,為未來腺相關(guān)病毒在耳聾中的應(yīng)用提供新思路。
【關(guān)鍵詞】腺相關(guān)病毒,遺傳性耳聾,基因治療,載體
Foundation item:The national 973 program of major scientific research program stem cell project(2012CB967900);The national 973 plan major scientific problem oriented project(2011CBA01000);National 863 project young scientists(2014AA020510);National Natural Science foundation of China general project(NSFC #81271082,81400472);National Natural Science foundation of China general project(81470684);Special Cultivating and Developing Program of Beijing Science and Technology Innovation Base (z151100001615050).Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest.
近年來研究表明新出生的1000名嬰兒當(dāng)中,會有1-2個(gè)出現(xiàn)先天性耳聾[1]。遺傳性非綜合征感音神經(jīng)性耳聾目前尚無有效的藥物治療方法,助聽器以及人工耳蝸植入雖然可以幫助大部分耳聾患者獲得聽力,但恢復(fù)程度有限。然而,大部分遺傳性非綜合征感音神經(jīng)性都是由于基因純合隱性突變,單基因突變主要影響毛細(xì)胞,支持細(xì)胞,血管紋的功能,造成嚴(yán)重的聽力喪失[2、3]。目前超過100個(gè)耳聾基因已被證實(shí),并且對于耳聾的分子病理學(xué)的研究以及診斷耳聾基因突變的能力已經(jīng)有了大大的提升[4],所以越來越多的研究者想通過基因治療實(shí)現(xiàn)聽功能的恢復(fù)。如何選擇低毒、高效、靶向性強(qiáng)的載體,協(xié)助目的基因進(jìn)入靶細(xì)胞并正確表達(dá),是基因治療過程中必須解決的難點(diǎn)問題[7]。近20年的臨床研究已經(jīng)證實(shí),腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的重組基因藥物(rAAV基因重組藥物)在血友病、癌癥、糖尿病、纖維化、癲癇等疾病中具有良好應(yīng)用前景[8]。目前也有大量文獻(xiàn)證實(shí),腺相關(guān)病毒可以攜帶目的基因轉(zhuǎn)染內(nèi)耳細(xì)胞,本文目的闡述腺相關(guān)病毒載體在遺傳性非綜合征感音神經(jīng)性基因治療方面的應(yīng)用。
將目的基因轉(zhuǎn)移至活體總體可分為病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(生物學(xué)方法)、非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(非生物學(xué)方法)兩大類型[5]。非病毒載體包括脂質(zhì)體,陽離子聚合物,蛋白多肽等,它們相對安全但是低效。因此,病毒載體應(yīng)用廣泛[9]。研究表明,病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率較高,因此它也是使用最多的基因治療載體。常用的病毒載體有反轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、單純皰疹病毒載體、這幾種病毒既可以在離體轉(zhuǎn)染,也可以活體轉(zhuǎn)染。反轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體以及單純皰疹病毒載體因?yàn)楦腥炯?xì)胞有限,不能有效轉(zhuǎn)染毛細(xì)胞,低表達(dá)等原因在感音神經(jīng)性耳聾基因治療中不常用[5、6]。腺病毒載體雖然導(dǎo)入效率高,感染性強(qiáng),也存在成功轉(zhuǎn)染內(nèi)耳細(xì)胞的研究結(jié)果,但腺病毒存在局限性,由于不整合宿主基因內(nèi),其僅能在細(xì)胞內(nèi)短期存在,故在基因治療中可能需多次導(dǎo)入腺病毒,這可能會導(dǎo)致對腺病毒產(chǎn)生免疫反應(yīng),從而阻止重復(fù)感染目的細(xì)胞,降低腺病毒載體的有效性,而腺病毒的廣泛感染范圍,也使其缺乏明顯的組織特異[19]。目前被應(yīng)用在遺傳性非綜合征感音神經(jīng)性耳聾基因治療中最多的病毒載體是腺相關(guān)病毒載體。
腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒,是目前所發(fā)現(xiàn)的動物病毒中最小的病毒,其基因組DNA小于5kb,無包膜,外形為裸露的20面體顆粒[5]。病毒顆粒的直徑在20 一25nm之間,病毒衣殼一般由3種衣殼蛋白(60一80KD)組成,含有大小在4.7一6kb之間的線性單鏈DNA基因組[25]?;蚪M中有3個(gè)啟動子( P5、P19和P40)和2個(gè)開放閱讀讀框( ORF),rep和cap。rep編碼4個(gè)重疊的多功能蛋白,即Rep78、Rep68、Rep52 與Rep40。其中Rep78與Rep68參與AAV的復(fù)制與整合,Rep52與Rep40具有解螺旋酶和ATP酶活性,與Rep78、Rep68共同參與單鏈基因組的復(fù)制; cap編碼的VP1 ( 90 kDa)、VP2 ( 72kDa)和VP3( 60 kDa)是裝配成完整病毒所需的衣殼蛋白,它們在病毒整合、復(fù)制和裝配中起重要作用[36]。它相對于腺病毒來說具有明顯的優(yōu)勢:1.安全性高:是一種非致病性微生物,作為新型安全載體,對人類無致病性;2.免疫原性弱;3.宿主范圍廣:能感染分裂期和非分裂期細(xì)胞;4.物理性質(zhì)穩(wěn)定:在56℃的溫度下1-2小時(shí)感染活性無明顯下降,pH值在3-9范圍內(nèi)變動,對AAV的活性沒有明顯的影響,在4℃條件下可長期保存,在不含特殊成份的普通PBS緩沖液中,活性無明顯下降,此外AAV還能以凍干的形式保存,非常便于運(yùn)輸和攜帶[37]。5.表達(dá)穩(wěn)定:定點(diǎn)整合到靶細(xì)胞的染色體上,持續(xù)穩(wěn)定表達(dá),并可受到周圍基因的調(diào)控,兼具反轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體兩者的優(yōu)點(diǎn)。雖然腺相關(guān)病毒可攜帶5kb以下的目的基因,容量較小,但是大部分目的基因的cDNA片段都在3kb以下。所以腺相關(guān)病毒是現(xiàn)在感音神經(jīng)性耳聾基因治療的首選載體[5、10-12]。腺相關(guān)病毒有多種血清型,不同血清型轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型不同,這也與轉(zhuǎn)染方式,啟動子等有關(guān)[6]。例如AAV2在體外可轉(zhuǎn)染毛細(xì)胞及支持細(xì)胞[13],但是通過圓窗膜穿刺方式進(jìn)入體內(nèi)只能感染螺旋緣、螺旋神經(jīng)節(jié)及螺旋韌帶[14-16]。AAV5無論在體內(nèi)體外都無法轉(zhuǎn)染毛細(xì)胞,但是卻可以有效轉(zhuǎn)染螺旋神經(jīng)節(jié)、內(nèi)溝細(xì)胞以及Claudius細(xì)胞。Askew C 將AAV1、AAV2、AAV6、AAV8、AAV9攜帶GFP通過圓窗膜穿刺轉(zhuǎn)入離體新生乳鼠耳蝸毛細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這5種血清型都可以成功轉(zhuǎn)染,綠色熒光蛋白可以表達(dá)在內(nèi)外毛細(xì)胞,但AAV1對于內(nèi)外毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率最高,并且通過圓窗膜注射發(fā)現(xiàn)在新生乳鼠體內(nèi)也可以成功轉(zhuǎn)染[17]。Yunfeng Wang利用AAV2/1、AAV2/7轉(zhuǎn)染新生乳鼠,7天后觀察AAV2/1-CMV-GFP轉(zhuǎn)染毛細(xì)胞、Hensen’s細(xì)胞、Claudius 和OS細(xì)胞、血管紋邊緣細(xì)胞、中間細(xì)胞與AAV2/7-CMV-GFP、LV-CMV-GFP相比轉(zhuǎn)染率最高[18]。Omar Akil利用AAV2/1-VGLUT3-GFP通過圓窗膜穿刺轉(zhuǎn)染新生乳鼠,在內(nèi)毛細(xì)胞成功表達(dá)VGLUT3[21]。單基因突變主要影響毛細(xì)胞,支持細(xì)胞,血管紋的功能,造成嚴(yán)重的聽力喪失[2][3],而AAV1在活體中轉(zhuǎn)染毛細(xì)胞、支持細(xì)胞,血管紋的效率較高,因此AAV1已經(jīng)成為目前遺傳性非綜合征感音神經(jīng)性耳聾基因治療較為常用的血清型類型。
根據(jù)大量文獻(xiàn)顯示,目前內(nèi)耳基因治療的手術(shù)途徑主要是鼓階注射(圓窗膜穿刺)以及中階注射。圓窗膜穿刺更易用在臨床應(yīng)用上,損傷性較小,但中階注射在人耳中不易應(yīng)用在臨床上,更多的是在研究膜迷路中基因表達(dá)情況中有重要意義。Seiji B.Shibata用圓窗膜穿刺以及中階注射將BAAV-GFP導(dǎo)入豚鼠進(jìn)行比較,實(shí)驗(yàn)表明在聽功能學(xué)方面,中階注射ABR閾值會比鼓階注射升高的更多,證明中階注射更易造成聽力損失。在形態(tài)學(xué)方面,病毒載體通過中階注射會比鼓階注射有更多的基因表達(dá)量[20]。造成人類先天性耳聾Jevell and Lang-Nielsen(JLN)綜合征的編碼鉀通道亞族蛋白的基因Kcnq1表達(dá)在血管紋邊緣細(xì)胞[22],參與建立內(nèi)淋巴電位。將AAV1-Kcnq1-GFP用中階注射和圓窗膜穿刺兩種方式導(dǎo)入小鼠,實(shí)驗(yàn)表明在形態(tài)學(xué)方面,中階注射是唯一一種可以使基因在血管紋邊緣細(xì)胞成功表達(dá)的手術(shù)方式,圓窗膜穿刺看不到血管紋細(xì)胞有任何表達(dá)。在功能學(xué)方面,將攜帶有目的基因Kcnq1的病毒載體用兩種方式導(dǎo)入Kcnq1基因敲除小鼠,通過中階注射可出現(xiàn)ABR有明顯改善,但是通過圓窗膜穿刺ABR沒有任何的好轉(zhuǎn)[23]。Yunfeng Wang也在文中表示,通過中階注射可以使血管紋細(xì)胞有較高的轉(zhuǎn)染率[18]。這兩種注射各有優(yōu)劣,今后實(shí)驗(yàn)可以根據(jù)自己的目標(biāo)細(xì)胞來選擇導(dǎo)入方式。
目前已經(jīng)有很多的實(shí)驗(yàn)利用AAV1成功的將目的基因?qū)牖铙w動物體內(nèi)進(jìn)行基因治療,在形態(tài)學(xué)和功能學(xué)上都有了明顯的好轉(zhuǎn)(見表1)。Vglut3是編碼囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體3(VGLUT3)的基因,內(nèi)耳毛細(xì)胞表達(dá)VGLUT3,如果缺乏VGLUT3將造成聽力喪失[24]。聽力喪失是由于內(nèi)毛細(xì)胞釋放谷氨酸減少,內(nèi)毛細(xì)胞傳入突觸的突觸傳導(dǎo)喪失[26]。利用Vglut3基因敲除小鼠,模擬Vglut3純合突變模型,利用圓窗膜穿刺鼓階將AAV1-Vglut3-GFP導(dǎo)入到P0-P12小鼠內(nèi)耳。在形態(tài)學(xué)方面,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見100%在內(nèi)毛細(xì)胞表達(dá)。在聽功能學(xué)方面,導(dǎo)入P0-P12小鼠,7-14天檢測,ABR閾值在正常范圍內(nèi),可以持續(xù)至少7周,其中有兩只小鼠可以保持1年半。如果在P1-P3導(dǎo)入目的基因可以得到更好的內(nèi)毛細(xì)胞表達(dá),以及更長時(shí)間的聽力恢復(fù)[21]??缒ゎ愃仆ǖ?1(TMC1)突變會造成人類常染色體隱性遺傳DFNB7/11和常染色體顯性遺傳DFNA36。小鼠制成相應(yīng)模型-Tmc1敲除模型以及Tmc1顯性點(diǎn)突變模型,利用圓窗膜穿刺將AAV1-Tmc1-GFP導(dǎo)入到P0-P2小鼠內(nèi)耳。在形態(tài)學(xué)方面,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見大部分在內(nèi)毛細(xì)胞出現(xiàn)基因表達(dá),在頂回極少外毛細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)染。在聽功能學(xué)方面,ABR閾值不完全恢復(fù),相對于野生型還是有所升高,DPOAE完全沒有恢復(fù)[17]。Kcnq1基因表達(dá)鉀通道亞族蛋白,參與內(nèi)淋巴液鉀離子的分泌,建立內(nèi)淋巴電位[27]。由于Kcnq1只表達(dá)在血管紋中間細(xì)胞,所以通過中階導(dǎo)入將AAV1-Kcnq1-GFP導(dǎo)入到Kcnq1-/- P0-P2小鼠體內(nèi)。在形態(tài)學(xué)方面,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,75±5%表達(dá)在底回邊緣細(xì)胞,71±8%表達(dá)在中回邊緣細(xì)胞,61±10%表達(dá)在頂回邊緣細(xì)胞。在聽功能學(xué)方面,治療后的聽力ABR閾值可達(dá)40dB SPL,雖然比野生型ABR閾值30dB SPL還是高,但是已經(jīng)較之前未治療時(shí)閾值達(dá)到90dB SPL有了很大的改善。聽力保護(hù)作用可以穩(wěn)定存在18周,然后以1.4dB/w的速度下降,在30w后治療組總的ABR閾值增加17dB[23]。流行病學(xué)研究表明在基因造成的耳聾中都是由于Gjb2單個(gè)基因突變造成。Gjb2編碼耳蝸連接蛋白Cx26,在哺乳動物非感覺細(xì)胞間起到細(xì)胞間耦合作[28-32]。AAV1-Gjb2-GFP通過中階注射導(dǎo)入Gjb2敲除老鼠的耳蝸中,在形態(tài)學(xué)方面觀察,基因可以在毛細(xì)胞、Hensen’s細(xì)胞、Claudius細(xì)胞、外溝細(xì)胞、錘形細(xì)胞以及邊緣細(xì)胞有效表達(dá)。在聽功能學(xué)方面,ABR測定在4KHz-32KHz范圍內(nèi),治療組幾乎恢復(fù)正常[33]。
腺相關(guān)病毒也存在局限性,比如生產(chǎn)病毒的過程繁瑣,基因表達(dá)有明顯的“滯后性”等缺點(diǎn)??傮w上rAAV基因重組藥物的臨床研究仍處于初始階段,除了免疫原性、安全性外,如何實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的靶向性,如何有效調(diào)控目的基因的表達(dá),如何提高轉(zhuǎn)染效率、表達(dá)效率、基因持久表達(dá)、目的基因包裝容量,如何解決rAAV基因重組藥物的制劑學(xué)技術(shù)、藥代動力學(xué)等都是臨床應(yīng)用需要解決的問題[12]。由于在孩童時(shí)期,AAV感染較為常見,導(dǎo)致很多人存在AAV獲得性免疫,帶有AAV中和抗體影響AAV基因治療的效率,因此目前一種新血清型AAV載體出現(xiàn)--bAAV[6]。除了腺相關(guān)病毒的局限性是目前存在的一大問題以外,何時(shí)進(jìn)行基因干預(yù)也是亟待解決的問題。對于有學(xué)者提出,1.毛細(xì)胞纖毛損傷階段是基因治療的最好時(shí)機(jī),通過完全修復(fù)或纖毛再生達(dá)到功能的完全或部分恢復(fù);2.內(nèi)耳毛細(xì)胞雖有損傷但沒有壞死,支持細(xì)胞和神經(jīng)纖維基本正常,所以有恢復(fù)形態(tài)和功能的機(jī)會,這個(gè)階段導(dǎo)入基因應(yīng)該有效,是基因治療的最關(guān)鍵時(shí)機(jī);3.毛細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷但支持細(xì)胞尚存,是毛細(xì)胞再生的搶救階段,而且還
表1 AAV1將目的基因?qū)牖铙w動物內(nèi)耳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Comparison of the experimental results on adeno-associated virus 1 vector transforming target gene into cochlea in vivo
目前病毒載體在基因治療上雖然取得了一些成果,但是仍然存在一些局限性,在恢復(fù)效果以及持續(xù)時(shí)間穩(wěn)定性等方面不夠理想,在未來我們可以嘗試將病毒載體基因治療與人工耳蝸相結(jié)合實(shí)現(xiàn)功能方面更好的恢復(fù)。另外,目前已有眾多學(xué)者用AAV1攜帶不同目的基因轉(zhuǎn)染活體動物,已取得了初步的成果,但是所應(yīng)用的動物模型幾乎都是嚙齒類動物,比如小鼠或是豚鼠,沒有將基因成功轉(zhuǎn)入大型哺乳類動物中。Mitf-M白化耳聾榮昌豬家系是國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的首個(gè)豬的遺傳性聽力缺陷家系,也是首個(gè)Mitf-M基因突變的大型哺乳動物耳聾模型。豬是醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中除靈長類以外和人類進(jìn)化關(guān)系最近的物種。豬與人在聽覺器官的形態(tài)和結(jié)構(gòu)方面具有極高的相似性。因此,豬模型在耳科領(lǐng)域的應(yīng)用具有較大潛力。在內(nèi)耳中,MITF特異性表達(dá)在血管紋中間細(xì)胞中,參與內(nèi)淋巴電位的形成。在人類,MITF-M基因突變會導(dǎo)致Waardenburg綜合征2A型和Tietz綜合征,其表現(xiàn)為皮膚、毛發(fā)、虹膜著色異常(虹膜異色和早期變灰)以及感音神經(jīng)性耳聾。我們將來可以利用類似于Mitf-M白化耳聾榮昌豬這種動物模型進(jìn)行AAV1基因治療,實(shí)現(xiàn)遺傳性非綜合征感音神經(jīng)性耳聾基因治療的另一大突破[35]。
可以爭取在Corti器細(xì)胞構(gòu)架沒有塌陷之前進(jìn)行干細(xì)胞導(dǎo)入,所以這個(gè)階段內(nèi)細(xì)胞移植可能有效地實(shí)現(xiàn)聽力恢復(fù);4.Corti器完全失去構(gòu)架,僅僅殘留上皮層或瘢痕化,基因?qū)胪耆珶o效,即使干細(xì)胞導(dǎo)入也會面臨困難,如何重塑Corti器構(gòu)架是巨大挑戰(zhàn)[34]。因此,應(yīng)根據(jù)不同耳聾基因表達(dá)的部位、時(shí)間來決定進(jìn)行基因干預(yù)的時(shí)間窗。
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·聽覺研究新模型專輯·
Application of adeno-associated virus gene vectors in hereditary non-syndromic sensorineural hearing loss
SHI Xunbei1,WU Nan2,GUO Weiwei2,YANG Shiming2,LIN Chang1
1Department of Otolaryngology,First Affiliated Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China 2Department Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Oto-Neurobiology Centre,Institute of Otolaryngology,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China
【Abstract】Adeno-associated virus has been used in gene therapies due to its unique gene vector advantages.Large amount of literature has demonstrated successful use of adeno-associated virus carrying various target genes in animal models of hereditary hearing loss with different approaches,to be expressed in hair cells,stria vascularis,support cells,spiral ganglion cells,etc,for the purpose of restoration of morphology and function.This paper summarizes the application of adeno-associated virus gene vectors in hereditary hearing loss,its advantages,successful experiences and problems in the past,and shares new ideas in its utilities in the future.
【key words】adeno-associated virus,hereditary hearing loss,gene therapy,vectors
收稿日期:(2016-01-15)
Corresponding author:LIN ChangEmail:linc301@yahoo.com
通訊作者:林昶,Email:linc301@yahoo.com
作者簡介:史珣貝,在讀研究生,研究方向:基因治療與毛細(xì)胞再生
基金項(xiàng)目:國家973計(jì)劃重大科學(xué)研究計(jì)劃干細(xì)胞項(xiàng)目(2012CB967900);國家973計(jì)劃重大科學(xué)問題導(dǎo)向項(xiàng)目(2011CBA01000);國家863青年科學(xué)家項(xiàng)目(2014AA020510);國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(面上項(xiàng)目81271082,青年基金81400472);國家自然科學(xué)基金(81470684);北京科技創(chuàng)新基地培育與發(fā)展專項(xiàng)(z151100001615050);重慶市基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(11611,14440)
DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.01.008
【中圖分類號】R764.43
【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A
【文章編號】1672-2922(2016)01-37-6