張依德 王遠(yuǎn)亮

（重慶大學(xué)生物工程學(xué)院 重慶 400044）

MCM與核心組蛋白基因的負(fù)相關(guān)表達(dá)模式的初步探討

張依德 王遠(yuǎn)亮

（重慶大學(xué)生物工程學(xué)院 重慶 400044）

本研究采用了熒光定量PCR技術(shù)，用穩(wěn)定表達(dá)的管家基因?yàn)閮?nèi)參基因，分析MCM及核心組蛋白家族基因負(fù)相關(guān)模式的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況，以探索它們之間的關(guān)系，以期為基因的負(fù)相關(guān)表達(dá)模式提供支持。結(jié)果顯示：兩組基因在細(xì)胞周期中不論何時(shí)上調(diào)或下調(diào)，只要一組基因出現(xiàn)上調(diào)，另一組基因總是出現(xiàn)下調(diào)的情況，也就是說兩組基因的表達(dá)模式總是相反的。Clb-Cdk1激酶在MCM基因和核心組蛋白基因的轉(zhuǎn)錄過程中扮演著極其重要的角色，它可以調(diào)控兩組基因的表達(dá)，是導(dǎo)致兩組基因呈負(fù)相關(guān)模式關(guān)鍵點(diǎn)。

釀酒酵母 負(fù)相關(guān)模式 細(xì)胞周期 熒光定量PCR

對(duì)于基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建都是在識(shí)別相似表達(dá)基因或正相關(guān)表達(dá)基因的相互作用，而當(dāng)前的研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)的表達(dá)上調(diào)或者下調(diào)同時(shí)會(huì)導(dǎo)致其上游或下游一個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)的改變，據(jù)此提出“負(fù)相關(guān)模式”這一概念。本課題組就此模式提出NCFCA算法，并將其應(yīng)用于研究釀酒酵母細(xì)胞周期的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)微小染色體維持蛋白基因與核心組蛋白基因可能符合負(fù)相關(guān)模式概念。

對(duì)兩組基因進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果顯示它們都具有多種相似功能，主要體現(xiàn)在共同參與DNA構(gòu)象變化、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物的組裝、細(xì)胞成分的組裝和合成等。因此我們對(duì)這兩組基因在酵母細(xì)胞周期中的表達(dá)情況進(jìn)行具體探討與研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

實(shí)驗(yàn)室野生型BY4743，W303A。

1.1.2 主要試劑及儀器

蛋白胨，酵母粉，葡萄糖，瓊脂粉；SYBR、RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒；α因子；PCR儀、凝膠成像、PCR電泳儀系統(tǒng)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的釀酒酵母的目標(biāo)基因序列設(shè)計(jì)引物。1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 釀酒酵母細(xì)胞周期同步化

酵母細(xì)胞W303、BY4741于YPD培養(yǎng)基25℃水浴鍋中培養(yǎng)8-10個(gè)小時(shí)，然后再置于25℃有氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。加入α因子到培養(yǎng)基中，使其濃度為600ng/ml。在25℃有氧培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)候，水洗，重新加入到新鮮培養(yǎng)基中以有利于細(xì)胞重新進(jìn)入有絲分裂。通過計(jì)數(shù)發(fā)芽細(xì)胞量及檢測(cè)芽的大小來評(píng)估酵母細(xì)胞同步化水平。

1.2.2 Total RNA的提取

酵母細(xì)胞經(jīng)同步化處理后每10min取樣一次，共取樣130min（約二個(gè)細(xì)胞周期）。使用試劑盒提取酵母總RNA，跑瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)所提取R NA的完整性。

1.2.3 全RNA反轉(zhuǎn)錄

使用試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。因每隔10分鐘取樣一次，RNA易降解，故采用兩步法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。所得基因組c D N A作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)樣品。

將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA保存在—4℃冰箱中，可長(zhǎng)期保存。

1.2.4 熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR

以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，ACT1、ALG9為內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩個(gè)家族共14個(gè)基因在三個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)的表達(dá)情況。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)胞周期同步化處理

經(jīng)α因子處理2h后，水洗加入新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，每10分鐘取樣一次，顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)酵母細(xì)胞發(fā)芽率及細(xì)胞核大小。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示細(xì)胞基本處于細(xì)胞周期內(nèi)同一階段，完成同步化處理，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)時(shí)定量PCR等實(shí)驗(yàn)。

2.2 熒光實(shí)時(shí)定量PCR

選擇使用酵母菌ACT1及ALG9為內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)14個(gè)基因的表達(dá)變化情況。據(jù)內(nèi)參基因表達(dá)量對(duì)比得出：隨著細(xì)胞周期的進(jìn)行，MCM家族6個(gè)基因表達(dá)呈現(xiàn)出在酵母細(xì)胞周期內(nèi)呈現(xiàn)出周期性的表達(dá)趨勢(shì)，從M期后期和G前1期開始，6個(gè)基因的表達(dá)水平逐漸上調(diào)直至最高表達(dá)水平，然后開始逐漸下調(diào)，到M期表達(dá)水平最低，然后隨著G1前期開始又重新開始上調(diào)；而組蛋白家族8個(gè)基因也呈現(xiàn)出周期性表達(dá)的趨勢(shì)，從G1期后期和S期前期開始，8個(gè)基因的表達(dá)呈下調(diào)的趨勢(shì)，到直到最低表達(dá)水平，隨后開始逐漸上調(diào)，到M期表達(dá)接近最高水平。

綜合比較兩組基因在細(xì)胞周期中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)不管上調(diào)或下調(diào)的時(shí)間，只要一組基因出現(xiàn)上調(diào)，另一組基因總是出現(xiàn)下調(diào)的情況，也就是說兩組基因的表達(dá)模式總是相反的。這一結(jié)果符合“負(fù)相關(guān)模式”這一概念，也就是說兩組基因?yàn)樨?fù)相關(guān)模式。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究中酵母細(xì)胞M C M與組蛋白兩組基因在D N A復(fù)制起始及延伸過程中具有相似的同能，但在多個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)對(duì)兩組基因的表達(dá)的上調(diào)與下調(diào)同時(shí)改變，并出現(xiàn)相反表達(dá)模式。考慮兩個(gè)基因之間能量守恒情況，當(dāng)一個(gè)基因上調(diào)時(shí)，它必須要從另外一個(gè)基因獲取一部分能量，以維持上調(diào)，同時(shí)使得另外一個(gè)基因的表達(dá)下調(diào)。此外，同一通路中和兩個(gè)通路之間的基因也會(huì)存在負(fù)相關(guān)性，負(fù)相關(guān)基因具有一定的功能相似性。由此本課題組提出了兩個(gè)基因的負(fù)相關(guān)配對(duì)是一個(gè)全新的概念。

目前本研究對(duì)MCM與組蛋白這一對(duì)負(fù)相關(guān)配對(duì)基因形成的原因進(jìn)行了理論數(shù)據(jù)及實(shí)驗(yàn)分析，得出結(jié)果如下：

在M的后期和G1的前期，Clb-Cdk1抑制Yox1和Yhp1的表達(dá)，不再去抑制啟動(dòng)子抑制蛋白Mcm1，從而使得MCM基因得以表達(dá)；與此同時(shí)，Clb-Cdk1則與其他細(xì)胞周期蛋白一起作用，招募RSC復(fù)合物以及HIR復(fù)合物做為抑制物結(jié)合到HTA1-HTB1的啟動(dòng)子區(qū)，從而抑制組蛋白基因的轉(zhuǎn)錄。

在M/G1期之外，Clb-Cdk1不再抑制Yox1和Yhp1的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子Mcm1與抑制子Yox1和Yhp1結(jié)合形成復(fù)合物，這兩個(gè)復(fù)合物再結(jié)合到MCM基因的啟動(dòng)子區(qū)，進(jìn)而抑制MCM基因的轉(zhuǎn)錄；同時(shí)，Clb-Cdk1與其他調(diào)控蛋白通過細(xì)胞周期信號(hào)以及磷酸化作用解除SWI和SNF對(duì)HIR復(fù)合物的抑制作用，使HIR復(fù)合物從共抑制子轉(zhuǎn)變成共激活子，從而激活組蛋白基因的轉(zhuǎn)錄。

以上事實(shí)表明：Clb-Cdk1在MCM基因和核心組蛋白基因的轉(zhuǎn)錄過程中扮演著極其重要的角色，它可以調(diào)控兩組基因的表達(dá)，是導(dǎo)致兩組基因呈負(fù)相關(guān)模式關(guān)鍵點(diǎn)，推測(cè)兩組基因可能同時(shí)參與細(xì)胞內(nèi)同一生物過程，但是由于細(xì)胞內(nèi)能量供求關(guān)系的平衡，所以兩者之間存在此消彼長(zhǎng)的關(guān)系，即一組基因上調(diào)則另一組基因則下調(diào)。

Q75

A

1674-2060（2016）02-0325-01