魏云階

（人大附中二分校 北京海淀 100097）

蘇云金芽孢桿菌的紫外線誘變及篩選實驗初步設計

魏云階

（人大附中二分校 北京海淀 100097）

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）由于其自身特點，由其制成的殺蟲劑已成為目前微生物防治害蟲的重要手段之一。雖然蘇云金芽孢桿菌制劑目前應用效果良好，但也存在一些隱患：長期使用該制劑會使害蟲抗性增加，因此尋找新的高毒力菌株勢在必行。本文以蘇云金芽孢桿菌的庫爾斯塔克亞種為研究對象，設計實驗以紫外線誘變的方法獲得毒力更強的菌種。

蘇云金芽孢桿菌 抗性 紫外誘變

蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑微生物殺蟲劑是目前使用最廣泛的一種微生物殺蟲劑。

目前生產的蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑還存在不足，為了克服不足，世界各國生物學家對蘇云金芽孢桿菌進行改造，從環(huán)境中分離篩選高毒力、廣譜的特異性野生蘇云金芽孢桿菌菌株已被眾多國家的研究人員研究，對現已篩選保存的菌種進行誘變以獲得目的菌種不失為一種行之有效的方法，通過多方面查詢資料和實驗，我選擇紫外線對蘇云金芽孢桿菌進行誘變，并確定實驗對象、制定實驗計劃：

1　實驗材料的準備

供試菌株：蘇云金芽孢桿菌的庫斯塔克亞種毒性檢驗昆蟲：黃粉蟲。

2　實驗計劃

2.1對該菌種進行鑒定

通過測OD值得出其生長曲線來了解該菌種的生長增殖情況。

將蘇云金芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d （28～30℃ ），制成2～3億/ml的菌懸液（芽孢占95%以上），取此懸液1 ml接種于盛有100ml牛肉膏蛋白脈培養(yǎng)基的300m1三角瓶中，30℃200～250rpm振蕩培養(yǎng)，定時取培養(yǎng)液，用無菌水將其稀釋5倍，用600分光光度計測定OD值，繪制菌株生長曲線。

2.2通過革蘭氏染色、芽孢染色和伴孢晶體染色來了解該菌種的外部形態(tài)。

2.2.1挑取少許經18～24h培養(yǎng)的待測菌株分別作涂片，風干、火焰固定，滴加結晶紫混合液初染約1min，再滴加碘液媒染約1min，水洗，吸干。經過乙醇完全脫色后，再用番紅染液染2～3min，水洗、風干。深紫色為革蘭氏染色陽性細菌，紅色為革蘭氏染色陰性細菌。

2.2.2芽孢染色，將待測菌株取培養(yǎng)72h左右后進行涂片、干燥、固定，用飽和的孔雀綠水溶液（約為7.6%）染l0min；再用木夾夾住載玻片在火焰上加熱4～5分鐘；去除染液后對玻片進行清洗，直至孔雀綠不再褪色。用番紅水溶液復染1min，水洗，待干燥后置于油鏡下觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色。

2.2.3伴孢晶體染色，按常規(guī)方法制成涂片，滴石炭酸復紅染液染1 min，然后風干或吸干，鏡檢。觀察有無伴胞晶體。

2.3對該菌種進行紫外誘變，在實驗過程中經過一系列探索得到的最優(yōu)誘變方法

2.3.1蘇云金芽孢桿菌的菌懸液的制備

挑取蘇云金芽孢桿菌斜面上的原菌至盛有10ml滅菌 LB培養(yǎng)液的試管中，置30 ℃振蕩培養(yǎng)箱中，100r/min 振蕩培養(yǎng)24h至對數期，獲得培養(yǎng)液。將培養(yǎng)液3000r/min 離心15min后，去上清液，再加入10ml滅菌生理鹽水打勻，進一步3000r/ min 離心15min ，重復上步 。離心后去上清，加入10ml磷酸緩沖液，用移液槍吹打成均勻的菌懸液。

2.3.2蘇云金芽孢桿菌培養(yǎng)液濃度的測定

取上述菌懸液用血球計數板計數，記錄5個中格的菌數，3次重復，計算母液中蘇云金芽孢桿菌的濃度。

每毫升芽孢桿菌數量=（5個中格的總菌數/5）×25×1000× 100，調整菌液濃度，一直到108/ml左右。

2.3.3紫外線照射

取上述制備好的菌懸液5ml于直徑9cm的滅菌的平地培養(yǎng)皿中。紫外燈打開預熱20min，以穩(wěn)定光源。

2.3.4后培養(yǎng)

照射完畢后菌懸液加入到盛有10ml滅菌的LB培養(yǎng)液的試管中，在適宜的溫度環(huán)境下培養(yǎng)1.5～2h。

2.3.5稀釋涂皿

后培養(yǎng)結束后，用滅菌磷酸緩沖液將培養(yǎng)液原液采用10 倍稀釋法稀釋，一直稀釋到1000個菌/ml，吸取0.1ml涂皿，每個涂兩個重復。并且以未經過紫外照射的菌懸液作為對照皿。 將涂布后的平皿置于30℃的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

2.4蘇云金芽孢桿菌突變體的篩選

對原菌進行三輪連續(xù)紫外誘變，每一輪從上一輪誘變中挑出十株突變菌，進入下一輪紫外誘變，最后挑出十株突變菌，低溫保存。

將保留菌種分別接種到盛有10ml滅菌的LB培養(yǎng)液的試管中，置30 ℃振蕩培養(yǎng)箱中，100r/min 振蕩培養(yǎng)24h。然后將菌液涂布到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，72h后觀察，挑出伴孢晶體最多的10株菌，用以進行下一步的毒力檢測。

2.5蘇云金芽孢桿菌突變體的毒力檢測

2.5.1菌株的活化

將10株挑選出的蘇云金桿菌突變體分別接種到LB培養(yǎng)基斜面上，置搖床上在30℃下培養(yǎng)1～3d后，用石碳酸復紅染色鏡檢，觀察到大量伴孢晶體后，取出，待用。

2.5.2突變菌株菌懸液的制備

將在培養(yǎng)基上已活化的10株蘇云金芽孢桿菌突變菌菌苔用無菌9ml洗下后倒入滅過菌的燒杯中，再加入1ml制成菌懸浮液，然后在3000r/min下離心15min后去上清液，然后再加入無菌蒸餾水反復清洗離心三次后，然后再加入無菌磷酸緩沖液稀釋分別制成8× 107、 8×106、8×105、8×104個/ml四個濃度的懸浮液。

2.5.3毒力檢測方法

采用葉片浸染飼喂法：取新鮮的甘藍嫩葉，切割成小片后將其均勻浸入到不同濃度的懸浮液中。然后取出，陰干，最后放入滅菌的平皿中。

同時用1mlBt原菌的菌懸液+ 9 mL無菌磷酸緩沖液配成的溶液涂于甘藍嫩葉上，為1號對照組；再以向黃粉蟲喂用清水沖洗過的橄欖嫩葉為2號對照組。

每個處理濃度放入黃粉蟲（2-3齡健康幼蟲）40頭，室溫下培養(yǎng)（20-28℃），每個處理和空白對照重復3次。將得到的十株誘變菌用黃粉蟲的三齡幼蟲進行室內生物毒力檢測，篩選得出毒力最強的突變菌。在上述實驗結束后進行結果檢查與數據分析。

［1］蒙顯英，黎起秦，馮家勛等.芽孢桿菌產生的抗菌物質的研究進展.中國植保導刊，2004年第12期13～15.

Q93

A

1674-2060（2016）05-0018-01

魏云階（1985—），女，漢，山東菏澤，理學學士，職稱初級，生命科學院。