潘浩王荻盧彤巖

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

漁用藥物防耐藥策略研究進展

潘浩1，2王荻1盧彤巖1

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

目前，藥物治療仍然是防治水產(chǎn)動物病害的主要方法，但其不合理應(yīng)用也誘發(fā)了大量耐藥細菌的產(chǎn)生。如何制定合理的漁用常用藥物防耐藥用藥策略已成為目前研究的重點。系統(tǒng)的綜述了耐藥突變選擇窗理論、中草藥防耐藥應(yīng)用及養(yǎng)殖條件影響在防耐藥用藥策略方向的研究進展。

聯(lián)合用藥；中草藥；養(yǎng)殖環(huán)境；防耐藥策略

近些年由于抗生素的過度及不合理利用，加速了細菌耐藥性的產(chǎn)生［1-8］。究其原因，抗生素單從一方面對細菌進行抑制，一旦細菌適應(yīng)并產(chǎn)生耐藥，此類抗生素的效果就大打折扣。因此如何制定抑制、殺滅病菌的同時避免耐藥性產(chǎn)生的科學(xué)合理的用藥策略是目前漁用藥物研究者研究的熱點問題。

1 耐藥突變選擇窗理論及其防耐藥用藥策略

1.1 防耐藥變異濃度和耐藥突變選擇窗

防耐藥變異濃度（mutant prevention concentration，MPC）這一概念是由美國學(xué)者Drlica［9］于2000年提出的，指的是一個防止耐藥的抗菌藥物濃度閥值，即防止細菌產(chǎn)生耐藥性的抑制細菌生長的藥物濃度。是評價抗菌藥物抑制細菌生長效應(yīng)的指標，反映的是藥物抑制細菌發(fā)生耐藥突變的能力。Dong等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在瓊脂平板上接種的細菌數(shù)量超過1010CFU的時候沒有發(fā)現(xiàn)細菌變異，這個能使細菌不產(chǎn)生耐藥性的藥物濃度值就是MPC。當抑菌藥物濃度達到MPC以上的時候細菌必須同時發(fā)生兩處耐藥突變才能生長。而細菌同時發(fā)生兩次耐藥突變的概率僅為10-14，這是一個極低的概率，因而抗菌藥物濃度在MPC之上時細菌大部分被殺死，基本不可能產(chǎn)生耐藥突變菌株［10，11］。最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），是測定抗菌藥物抑制細菌活性大小的指標，其定義為體外培養(yǎng)18-24 h后能抑制培養(yǎng)基內(nèi)細菌生長的最低藥物濃度，當藥物濃度低于MIC時，藥物抑菌效果消失但不會導(dǎo)致細菌耐藥突變體產(chǎn)生。而當藥物濃度介于MPC與MIC之間時，即便有很高的幾率抑制甚至殺滅細菌，但也很容易出現(xiàn)耐藥突變體，介于這兩者之間的濃度范圍就是耐藥突變選擇窗（mutant selection window，MSW）［12］。

1.2 基于MSW理論的防耐藥用藥策略

MSW理論認為當藥物濃度在MPC之下，并且在MIC之上的時候，才會導(dǎo)致細菌耐藥突變體的選擇性富集并且產(chǎn)生抗性。因此，可以通過選擇使用低MPC、窄MSW的藥物調(diào)整用藥方案或是通過藥物的聯(lián)合使用縮小或關(guān)閉MSW［13］?？s小或關(guān)閉MSW將會有極少甚至不會有耐藥突變體產(chǎn)生，可以將選擇性突變菌株擴增的機率降到最低。因此，可以通過使藥物濃度快速達到峰值，并且在最短的時間內(nèi)通過MSW，將血漿藥物在MSW的滯留時間降到最低，使其處于MPC以上的時間升到最高，以達到最大限度地縮短突變選擇時間的目的。方法二是縮小MIC與MPC的差距，縮小或者關(guān)閉MSW。其三是采取聯(lián)合用藥的方法，因為當兩種或多種不同作用機制的藥物同時存在于細菌生存的環(huán)境中時，細菌要繼續(xù)生長必須同時發(fā)生兩種及以上的耐藥突變，而發(fā)生兩種及以上的突變的概率極低，這樣就可以達到最大限度關(guān)閉MSW以抑制細菌同時防止耐藥菌株的產(chǎn)生。

聯(lián)合用藥是除了保證藥物達到合適的藥物濃度（MPC）之外的另一種經(jīng)常采用的防耐藥用藥策略。單一藥物治療的關(guān)鍵是組織或血液藥物濃度要高于藥物用藥安全劑量的MPC，并且在MSW以上的時間越長越好。然而在聯(lián)合使用幾種作用機制不同的藥物時，由于臨床安全劑量難以達到各自的MPC，因此可以通過匹配24 h用藥時曲線下面積（AUC24）與最小抑菌濃度（MIC）的比值（AUC24/MIC）來關(guān)閉MSW，這樣可以在達到理想的治療效果的同時盡量避免耐藥突變體的出現(xiàn)。

聯(lián)合用藥所引起的藥物相互作用的改變是使藥物效應(yīng)改變［14］，這種改變可能是作用性質(zhì)的變化，也可能是效應(yīng)強度改變，從而對藥物的有效性和安全性產(chǎn)生影響。藥物聯(lián)合使用所引起的藥效包括：使原有的效應(yīng)增強，即協(xié)同作用；使原有的效果減弱，即拮抗作用；產(chǎn)生毒性等不良反應(yīng)，即毒副作用；以及可能出現(xiàn)的互不影響的結(jié)果。因此在用藥的時候要充分了解藥物的藥效，避免拮抗作用與毒副作用的發(fā)生。

2 中草藥防耐藥用藥策略

中草藥由于其有效成分復(fù)雜、作用機制多樣，實驗發(fā)現(xiàn)體外抑菌試驗很難解釋中草藥在體內(nèi)的抗菌作用，這表明中草藥除了其表現(xiàn)出來的抑菌作用外，可能還存在其他作用機制協(xié)助進行抑菌，推測是通過其對細菌以及細菌所寄生的機體進行的多環(huán)節(jié)多途徑的綜合作用來實現(xiàn)［15］。近年來，中草藥在抑菌機制及防耐藥用藥策略方面的應(yīng)用也有了較系統(tǒng)的研究進展。

2.1 中草藥抑菌成分與機制

近幾年來，中草藥抑菌成分的研究方向逐漸轉(zhuǎn)向生物堿、黃酮類、多酚類及萜類等方面。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進步及新的儀器的研發(fā)，對含酚類成分的中草藥，如低分子質(zhì)量的有蒽醌及異戊烯黃酮，高分子質(zhì)量的有多酚類及原花色素、水解單寧等中草藥的研究也越來越多。

目前許多研究者認為，中草藥的抗菌作用機制主要包括抑制菌體內(nèi)能量的生成、抑制細菌生物膜的形成、改變細胞膜和離子通道的通透性、抑制細菌體內(nèi)酶的活性、增強中性粒細胞的吞噬功能、代謝產(chǎn)物發(fā)揮抗菌作用、抑制細菌蛋白質(zhì)的合成及減少細菌內(nèi)毒素的釋放。

2.2 中草藥逆轉(zhuǎn)細菌耐藥性研究

在研究新型抗生素藥物的同時，越來越多的學(xué)者開始把目光轉(zhuǎn)向使抗性細菌恢復(fù)對抗生素藥物的敏感性方面。由于成分復(fù)雜中草藥在這方面有其特有的優(yōu)勢，并且一些相關(guān)研究也證實中草藥在此方面具有較好的功效。

2.2.1 消除抗藥性（R）質(zhì)粒 在1970年之后，國內(nèi)外許多研究人員在試驗中通過消除細菌的R質(zhì)粒使細菌恢復(fù)對抗菌藥物的敏感性，但由于西藥的毒副作用較強，一直未能取得較好的效果，因此開始把目光投向傳統(tǒng)中草藥。研究結(jié)果表明，中草藥對消除細菌R質(zhì)粒的效果良好［16］，而且中草藥由于其作用機制對R質(zhì)粒的消除作用體內(nèi)明顯強于體外，這可能是因為在體內(nèi)細菌不僅受到藥物的抑制作用與機體的免疫作用，特別是先天性免疫系統(tǒng)的影響，而且同時還與受到機體的內(nèi)環(huán)境的影響有關(guān)。

目前，對中草藥黃芩、黃連進行的相關(guān)研究較多，兩者聯(lián)用效果明顯，可使R質(zhì)粒消除率提高10倍以上，其效果遠高于西藥。不同組分的中草藥對R質(zhì)粒消除率也不同，如從艾葉得到的乙醇提取物對R質(zhì)粒的消除率可達69.4%，艾葉提取的揮發(fā)油對R質(zhì)粒的消除率可達16.67%［17］。中草藥千里光對大腸桿菌R質(zhì)粒消除作用顯著，且含藥血清消除作用達14.9%［18］，明顯強于其水浸液。從R質(zhì)粒消除的表型來看，經(jīng)千里光水浸液作用后細菌均表現(xiàn)為單一耐藥性的丟失，而含千里光血清對其消除作用表現(xiàn)為多重耐藥性的丟失，其中以四環(huán)素的耐藥性消除最多。鞠洪濤等［19］研究表明，大蒜油等對大腸埃希氏菌氨芐青霉素的耐藥性有明顯消除作用。

2.2.2 抑制細菌主動外排泵 主動外排機制是多數(shù)耐藥菌耐藥性產(chǎn)生的原因之一，也是細菌多重耐藥性產(chǎn)生的原因之一［20］。諸多研究表明，中草藥可以通過抑制多種外排泵的活性使耐藥菌恢復(fù)對藥物的敏感性。宋戰(zhàn)昀等［21］構(gòu)建了含有norA外排泵基因介導(dǎo)的金黃色葡萄球菌的多重耐藥菌株，并篩選了4種中草藥浙貝母、射干、穿心蓮和菱角的提取物發(fā)現(xiàn)，這些中草藥的提取物可以抑制外排泵介導(dǎo)的金黃色葡萄球菌的耐藥性，并可以在不同程度上對金黃色葡萄球菌的耐藥性產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)作用。adeABC基因的過度表達導(dǎo)致鮑曼不動桿菌對環(huán)丙沙星產(chǎn)生耐藥性［22］，從中草藥蘿芙木根中提取的生物堿利血平對外排泵基因adeABC的表達有抑制作用，從而使鮑曼不動桿菌部分恢復(fù)對環(huán)丙沙星的敏感性。

2.2.3 抑制超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs） β-ESBLs產(chǎn)生抑菌作用是因為它可以水解抗菌藥物的有效成分，降低抗菌藥物的抑菌效果從而使細菌產(chǎn)生耐藥性。目前研究表明，部分中草藥可以抑制產(chǎn)ESBLs細菌菌株水解抗菌藥物，使其恢復(fù)對抗菌藥物的敏感性。劉平等［23］研究發(fā)現(xiàn)黃芩、黃柏、黃連、連翹和千里光這5種中草藥的提取物可以抑制產(chǎn)ESBLs細菌的抗藥性，與其他4種藥物相比黃芩抑菌效果更好。三黃湯、黃連解毒湯和五味消毒飲可以逆轉(zhuǎn)產(chǎn)酶大腸桿菌的抗藥性，其機制也是通過抑制ESBLs 的活性和表達以產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)效果的［24］。

2.2.4 抑制耐藥基因的表達 余道軍等［25］研究表明，提取蟾酥皮膚腺及耳后腺分泌的白色漿液，其水提液和醇提液在與含有耐藥基因TEM和CTX-M-9的大腸桿菌作用5 d后，可使細菌耐藥基因的mRNA的表達喪失，失去翻譯蛋白質(zhì)的功能，恢復(fù)了對藥物的敏感性。

2.3 中草藥用藥策略

目前關(guān)于中草藥對細菌的抑制作用機制和逆轉(zhuǎn)細菌耐藥性使其恢復(fù)對藥物敏感性的研究還處于初級階段，而且目前研究的大部分抑菌實驗是針對孤立單一的已產(chǎn)生耐藥性的菌株，還沒有大量進行以菌群為單位的抑菌實驗研究。中草藥抗菌的理念與中醫(yī)有相通之處，并非要將細菌全部殺滅，而是調(diào)整菌群與機體之間的“失衡狀態(tài)”以實現(xiàn)菌群與所寄生的機體之間的“再平衡”為目的。這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)提倡的抑制感染菌的同時又不傷害其他細菌維持菌群在機體內(nèi)的平衡的理念相吻合。目前“突變選擇窗”理論提倡的關(guān)閉突變選擇窗策略與多種不同機制的藥物同時作用殊途同歸，這也與中草藥的多途徑、多靶點機制具有相似性。但是中草藥抗菌的多途徑、多靶點機制是一個很寬泛的概念，其各成分作用途徑和靶點之間是否具有協(xié)同作用、抗菌作用機制與逆轉(zhuǎn)細菌耐藥性之間是否存在相關(guān)性等問題還有待深入研究。

3 養(yǎng)殖環(huán)境對防耐藥策略的影響

有研究表明，溫度、鹽度、光照等環(huán)境條件和藥物種類、給藥方式、動物種類等因素可能會影響藥物動力學(xué)參數(shù)及殘留消除規(guī)律，如何合理調(diào)整養(yǎng)殖條件進而滿足MSW防耐藥用藥策略要求的快速達峰，縮短血漿藥物濃度在MSW的滯留時間以避免耐藥性的產(chǎn)生，也逐漸受到漁藥給藥策略制定研究人員的關(guān)注。3.1 水流對防耐藥策略的影響

水流對魚類生存、生長影響巨大。水流通過刺激魚類的感覺器官，使其產(chǎn)生相應(yīng)的行為反應(yīng)和活動方式，進而影響魚類的運動方式、攝食、生長、代謝等生命活動［26-30］。宋波瀾等［31］以多鱗四須鲃幼魚為研究對象，研究逆流條件下多鱗四須鲃幼魚體內(nèi)代謝活動與藥物殘留，與靜水對照組相比的結(jié)果表明，停藥后各時間點（1、2和4 d）2.0 BL/s流速組魚肌肉鹽酸諾氟沙星含量均顯著減少（P<0.05），在停藥第6天藥物濃度已低于檢出限，而靜水對照組則在停藥12 d才低于檢出限，說明逆流運動在一定程度促進魚體內(nèi)的代謝，加速體內(nèi)殘留藥物的排除。藥物在體內(nèi)快速代謝減少了藥物在MSW的滯留時間，可有效降低細菌耐藥性的產(chǎn)生。劉海生等［32］對寬鰭鱲幼魚的研究也表明，水流刺激可以加速魚的代謝活動。

3.2 溫度對防耐藥策略的影響

溫度對魚的生長具有很大的影響，通過控制水溫來達到增強魚體代謝的目的，從而加速藥物在體內(nèi)的代謝，減少滯留時間以降低細菌耐藥性的產(chǎn)生。Lermen等［33］研究證實不同溫度（15、23和31℃）對銀鯰血液、肝臟和肌肉的代謝參數(shù)具有顯著的影響作用。楊貴強等［34］對溪紅點鮭幼魚的研究表明，在（5.5±0.5）℃-（17.5±0.5）℃溫度范圍內(nèi)，隨溫度的上升耗氧率和排氨率均顯著升高。汪文選等［35］對恩諾沙星在鯽魚體內(nèi)的藥動學(xué)研究表明20℃藥時曲線下面積、消除半衰期明顯大于25℃，而清除率明顯小于25℃。在鯽魚的腎臟和肝臟中，20℃藥物的達峰時間、分布半衰期、消除半衰期、藥時曲線下面積均明顯大于25℃，而清除率明顯小于25℃。對花尾胡椒鯛［36］、瓦氏黃顙魚［37］、石斑魚［38］、石鯛［39］、鮸［40］、鯉［41］和鯰［42］等研究也表明，溫度通過影響魚體組織的代謝率會對魚體排泄率產(chǎn)生一定影響，并且氨氮排泄率也會隨溫度升高而增加?？梢姡疁貤l件在一定程度上影響著藥物在水產(chǎn)動物體內(nèi)的代謝和消除，故而在實際養(yǎng)殖給藥時應(yīng)適當考慮不同水溫條件以確定合理的用藥策略，以達到降低細菌耐藥性產(chǎn)生的目的，在確保食品安全的同時可以通過減少在體內(nèi)的滯留時間以達到降低細菌耐藥性的目的。

3.3 鹽度對防耐藥策略的影響

鹽度是魚類生理與生化反應(yīng)的重要影響因子，主要通過對滲透壓的調(diào)節(jié)來影響魚類體內(nèi)的能量代謝［43］。在高、低滲透壓兩種情況下魚體會有不同的適應(yīng)機制：高滲透壓下通過增加內(nèi)環(huán)境的滲透壓；低滲透壓下啟用主動運輸或離子轉(zhuǎn)運蛋白的途徑來轉(zhuǎn)運離子［44］。而這兩種機制都需要額外能量的消耗，這也在一定程度上加速魚的機體代謝，從而會加速藥物在體內(nèi)的代謝，減少滯留時間以降低細菌耐藥性產(chǎn)生的可能。李金蘭等［45］對卵形鯧鲹的研究表明，在鹽度 15-30 時，隨鹽度增大卵形鯧鲹的耗氨率、排氨率、代謝率及排泄率均呈U型拋物線變化，并在鹽度20-25時有最小值。對中華圓田螺［46］、三疣梭子蟹［47］、中華絨螯蟹［48］及羅非魚［42］的研究均表明鹽度對機體的代謝有著顯著的影響。因此，可以考慮在用藥后調(diào)節(jié)水體的鹽度以加快藥物在魚體的代謝過程，減少細菌耐藥性產(chǎn)生的可能。

3.4 光照對防耐藥策略的影響

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，光照是一個重要而且復(fù)雜多變的生態(tài)因子。對生活在水體的生物而言，光照是一個具體而易變的因子［49］。王馨等［50］對三疣梭子蟹研究表明，在5種光照強度（0、200、800、1 500和3 500 lx）下，三疣梭子蟹的耗氧率和排氨率均有顯著差異，并且在1 500 lx 光照強度下，琥珀酸脫氫酶的活力處在較高水平，乳酸脫氫酶處在較低水平，表明蟹的有氧代謝能力高，整體代謝水平較高。另外有研究表明，光照可以通過影響牙鲆激素分泌而加速代謝［51，52］。制定最適的防耐藥用藥策略是否應(yīng)考慮光照因素的影響尚待進一步深入研究。

4 展望

細菌對抗菌藥物的耐藥性問題是21世紀對人類威脅最大的健康問題之一。藥物在使用的時候不僅要控制細菌感染，還應(yīng)防止細菌耐藥性的產(chǎn)生，更重要的是要將藥物對目標細菌外的菌群的影響降到最低。在選擇抗菌藥物及用藥方案的時候，不僅要考慮藥物的生物利用度、生物有效性、組織分布與藥效參數(shù)，還應(yīng)全方面綜合考慮細菌發(fā)生耐藥突變的機制、MPC和MSW。對于耐藥嚴重的細菌不能一味加大用藥劑量或頻頻更換藥物，要轉(zhuǎn)換用藥思路，采用相互拮抗的藥物組合殺死耐藥菌、協(xié)同型藥物組合殺死敏感菌以控制感染，當然用藥的前提是要篩選出合適的藥物組合。目前中草藥消除細菌耐藥性的研究基本上還處于起步階段，但中草藥抑制劑作為純天然制劑，同時作為一種新理論、新方法在臨床中對解決日趨嚴重的耐藥菌感染具有不可替代的作用和地位，同時也為遏制人源和動物源性細菌耐藥性的交互傳播、抑制細菌耐藥性提供了新的思路與方法。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Progress on the Strategies of Preventing Drug-resistance in Fishery

PAN Hao1，2WANG Di1LU Tong-yan1
（1. Heilongjiang River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Harbin 150070；2. College of Fisheries and Life Sciences，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

Currently，the drug treatment is still the main way of preventing and controlling the aquatic animal diseases，but abuse of drugs has also led to a large number of drug-resistant bacteria. How to formulate a reasonable strategies of preventing drug-resistance while applying common drugs in fishery has become the focus on the current study. This paper systematically reviewed the window theory of drugresistant mutation selection，and the research progress on the strategies of preventing drug-resistance such as applying Chinese herbs and the effects of culture conditions.

drug combination；Chinese herbs；culture environment；strategies of preventing drug-resistance

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.005

2015-06-30

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項經(jīng)費（201203085）

潘浩，男，碩士，研究方向：漁藥藥理及殘留檢測技術(shù)；E-mail：zcph6666@126.com

盧彤巖，女，博士，研究員，研究方向：水產(chǎn)動物病害；E-mail：lutongyan@hotmail.com